Narodowe Centrum Nauki

Głównym celem tego projektu jest opracowanie nowych krystalicznych fosforanów wapnia wzbogaconych w różnorodne jony o potencjalnym znaczeniu biomedycznym. Następnym podstawowym celem projektu jest opracowanie materiałów dwu- i wielofazowych o różnej charakterystyce uwalniania tych jonów.
Badania podstawowe realizowane w ramach projektu: Synteza różnych krystalicznych fosforanów wapnia (hydroksyapatytu (HA), ortofosforanów wapnia (βTCP oraz αTCP) wodorofosforanów wapnia (bezwodnego CaHPO4 (DCPA) oraz dwuwodnego CaHPO4∙2H2O (DCPD)) zawierających domieszki „obcych” jonów: kationów I, II lub III-wartościowych (np. K+ , Ag+ , Zn2+, Mn2+, Mg2+, Cu2+, Ga3+) oraz różnorodnych anionów (np. SeO3 2- , SeO4 2- , SiO4 4- , BO3 3- ). Zbadanie struktury i składu chemicznego otrzymanych podstawionych materiałów fosforanowowapniowych oraz badania fizykochemiczne tych materiałów. Planowane metody badawcze: rentgenowska dyfraktometria proszkowa (PXRD), spektroskopia w średniej podczerwieni (FT-IR), spektroskopia Ramana (R), spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego w ciele stałym (ssNMR), atomowa spektrometria absorpcyjna (ASA), fluorescencja rentgenowska z dyspersją fali (WD XRF) oraz spektrometria emisyjna ze wzbudzeniem plazmy (ICP OES). Analiza uwalniania jonów z otrzymanych materiałów (metoda spektrometrii mas ze wzbudzeniem plazmy ICP MS). Opracowanie materiałów dwu- oraz wielofazowych opartych o otrzymane podstawione materiały fosforanowo-wapniowe charakteryzujących się różną szybkością uwalniania obcych jonów. Ocena właściwości biologicznych otrzymanych materiałów. Powody podjęcia tematyki badawczej: Fosforany wapnia stanowią grupę nieorganicznych materiałów o istotnym znaczeniu w implantologii, medycynie regeneracyjnej oraz stomatologii. W ludzkich tkankach zmineralizowanych (tj. kościach, szkliwie, zębinie czy cemencie zębowym) nieorganicznym budulcem zapewniającym im twardość jest tzw. apatyt biologiczny czyli nanokrystaliczny hydroksyapatyt węglanowy zawierający wiele różnorodnych podstawień jonowych. Dlatego też syntetyczne materiały kościozastępcze, powłoki implantów metalicznych, cementy dokostne czy materiały stomatologiczne często zawierają w swym składzie fosforany wapnia, które zapewniają biokompatybilność, bioaktywność i niską cytotoksyczność. Od wielu lat najpopularniejszy wśród syntetycznych fosforanów wapniowych, hydroksyapatyt (HA) o wzorze sumarycznym Ca10(PO4)6(OH)2, a jednocześnie najsłabiej resorbowalny, skutecznie poddaje się domieszkowaniu różnymi jonami w celu wzbogacenia go o dodatkowe właściwości biologiczne, fizykochemiczne czy też mechaniczne. Z kolei bardzo mało jest wiadomo na temat możliwości podstawień jonowych w innych krystalicznych fosforanach wapniowych, np. ortofosforanie wapnia Ca3(PO4)2 (forma βTCP oraz αTCP), krystalicznym bezwodnym wodorofosforanie wapnia CaHPO4 (DCP) oraz dwuwodnym wodorofosforanie wapnia CaHPO4∙2H2O (DCPD). Nieliczne badania nad wzbogaceniem βTCP oraz αTCP pokazują, że takie materiały charakteryzują się lepszą rozpuszczalnością i szybszym uwalnianiem obcych jonów niż podstawione apatyty. Obecnie w medycynie stosuje się materiały dwufazowe (najczęściej zawierające czysty, niepodstawiony HA oraz βTCP w różnych proporcjach), które zapewniają lepszą bioaktywność i łatwiejszą osteointegrację. Zaplanowane w naszym projekcie opracowanie nowych podstawionych fosforanów wapnia ma na celu poszerzenie wiedzy w zakresie wymiany jonowej w wybranych krystalicznych fosforanach wapnia. Chcemy opracować materiały charakteryzujące się różną resorbowalnością i różną szybkością uwalniania jonów. Spodziewamy się, że wyniki zaplanowanych przez nas badań będą szczególnie ważne dla postępu biologii, medycyny i inżynierii materiałowej (projektowanie materiałów kościozastępczych).

Celem planowanych badań jest powiązanie aktywności systemów pomp odpowiedzialnych za oporność wielolekową (MDR) z profilami lekooporności szczepów klinicznych Stenotrophomonas maltophilia oraz poszukiwanie nowych systemów efflux obecnych u tego gatunku. Obecnie główne badania nad chorobotwórczością pałeczek Gram-ujemnych dotyczą szczepów z rodziny Enterobacteriaceae. Jednakże rola szczepów innych gatunków w chorobotwórczości również gwałtownie rośnie. Stenotophomonas maltophilia jest jedną z najczęściej izolowanych pałeczek Gramujemnych odpowiedzialnych za zakażenia szpitalne. Jest patogenem oportunistycznym, szczególnie niebezpiecznym dla pacjentów z obniżoną odpornością, rozległymi oparzeniami, długotrwale hospitalizowanych, chorych na mukowiscydozę. Szczepy S. maltophilia wywołują wiele poważnych zakażeń, w tym zapalenia płuc, zapalenia opon mózgowych, posocznice, które mogą osiągnąć, jak w przypadku bakteriemii, współczynnik śmiertelności nawet 69%. Zakażenia S. maltophilia stanowią bardzo poważny problem terapeutyczny z uwagi na szeroko występującą oporność tych szczepów na różne rodzaje antybiotyków i chemioterapeutyków. Obecność pomp MDR (multi-drug resistance) jest jednym z najbardziej istotnych mechanizmów oporności S. maltophilia. Pompy MDR są zdolne do usuwania różnych klas antybiotyków, chemioterapeutyków i środków dezynfekcyjnych na zewnątrz komórek bakterii. W badaniach wstępnych wykazano powszechne występowanie wśród badanych izolatów S. maltophilia systemów efflux z rodziny ABC i niektórych pomp z rodziny RND. Biorąc pod uwagę mnogość systemów pomp wielolekooporności u blisko spokrewnionego gatunku Pseudomonas aeruginosa należy poszukiwać nowych systemów wielolekooporności także u szczepów S. maltophilia. Badania będą obejmować grupę ponad 100 szczepów S. maltophilia wyizolowanych od pacjentów hospitalizowanych w warszawskich szpitalach. W ramach prowadzonych prac będą poszukiwane geny kodujące systemy pomp z rodziny RND oraz zostanie określony udział wybranych systemów w oporności szczepów przy zastosowaniu testów lekowrażliwości oraz metody real-time RT-qPCR. Sekwencjonowanie DNA genomowego wybranych szczepów o nietypowym fenotypie oporności umożliwi odkrycie nowych systemów efflux obecnych u S. maltophilia. Każdego roku obserwuje się coraz większą liczbę szczepów S. maltophilia opornych na związki stosowane w terapii zakażeń. Wzrasta także liczba osób z obniżoną odpornością podatnych na zakażenia S. maltophilia. Są to bardzo niepokojące zjawiska, które wymagają ciągłego poszerzania wiedzy o patogenach oportunistycznych, a także genach i mechanizmach oporności. Do tej pory, w Polsce nie prowadzono żadnych badań dotyczących pomp MDR występujących u klinicznych izolatów S. maltophilia, badania światowe są fragmentaryczne. W prezentowanym projekcie zostaną one przeprowadzone po raz pierwszy, co więcej, na tak szeroką skalę – będą obejmować wszystkie opisane do tej pory systemy pomp MDR z rodzin RND i ABC, oraz zostaną wykonane z udziałem dużej grupy szczepów. Proponowane badania umożliwią dogłębną charakterystykę szczepów i dostarczą wiedzy na temat sytuacji epidemiologicznej i oporności szczepów w Polsce. Umożliwią też porównanie cech szczepów polskich ze szczepami izolowanymi w różnych rejonach świata. Przeprowadzone sekwencjonowanie DNA genomowego wyselekcjonowanych szczepów umożliwiające odkrycie nowych systemów efflux będzie poszerzało światową wiedze o mechanizmach oporności szczepów S. maltophilia. Ponadto uzyskane dane poszerzą wiedzę użyteczną w terapii zakażeń S. maltophilia nie tylko w Polsce, ale także będą wskazówką co do prawdopodobieństwa procentowego udziału nadekspresji systemów MDR w lekooporności szczepów tej pałeczki w innych rejonach świata.

1. Cel prowadzonych badań/hipoteza badawcza
Zespoły padaczkowe, których podłoże molekularne stanowią mutacje genu SCN1A kodującego podjednostkę a potencjałozależnego kanału jonowego Na+ (Nayl.l) stanowią grupę jednostek chorobowych o dużej zmienności fenotypowej. Są to zarówno padaczki o stosunkowo łagodnym obrazie klinicznym, jak i katastroficzne encefalopatię padaczkowe, np. zespół Dravet. Do tej pory nie ustalono zależności pomiędzy rodzajem i lokalizacją mutacji w genie SCN1A a obrazem klinicznym obserwowanego zespołu, w zdecydowanej większości przypadków nie wiadomo też jakie funkcje potencjałozależnego kanału jonowego Na+ ulegają zaburzeniu w poszczególnych przypadkach choroby. Biorąc pod uwagę fakt zmienności obrazu klinicznego dla konkretnych mutacji, nawet u osób spokrewnionych można postawić hipotezę, że fenotyp pacjenta (typ zespołu padaczkowego) jest wynikiem rodzaju patologii molekularnej i zaburzenia funkcjonalnego podjednostki Nayl.l, na co nakładać się może wpływ czynników modyfikujących ostateczny obraz kliniczny choroby.
Celem niniejszego projektu jest zbadanie metodami in vitro, oraz przyżyciową związków pomiędzy rodzajem mutacji SCNIA a zaburzeniami funkcji potencjałozależnych kanałów jonowych Na+, oraz wpływu potencjalnych genetycznych modyfikatorów na obraz kliniczny choroby. Wyniki pozwolą także na poznanie osobniczej heterogenności genetycznej w obrębie genów kodujących inne kanały jonowe u pacjentów z populacji polskiej a także ich wpływ na zmienność fenotypu analizowanych zespołów padaczkowych.
2. Zastosowana metoda badawcza/metodyka
Wybrane mutacje genu SCNIA stwierdzane u pacjentów z zespołem Dravet, odtworzone w cDNA genu SCNIA poddane zostaną ekspresji w modelowych nieneuronalnych komórkach HEK tsA201. Potencjałozależne prądy jonowe Na+ w tych komórkach zbadane zostaną przy użyciu techniki voltage-clamp w celu określenia właściwości kintycznych prądów jonowych Na + występujących w różnych typach mutacji genu SCNIA. U pacjentów przeprowadzone zostanie badanie pobudliwości błony nerwów obwodowych które pozwoli na wykazanie, czy dysfunkcje kanałów jonowych Na+ są uchwytne klinicznym badaniem neurofizjologicznym i czy wyniki tego badania wykazują korelację z wynikami doświadczeń voltage-clamp. W celu identyfikacji czynników wpływających na zależny od mutacji genu SCNIA fenotyp, przeprowadzona zostanie, z zastosowaniem eksomowego sekwencjonowania następnej generacji, analiza zmienności genów kodujących kanały jonowe które mogą wpływać na funkcję potencjałozależnych kanałów jonowych Na', a więc stanowić genetyczne modyfikatory przebiegu zespołu padaczkowego.
3. Wpływ spodziewanych rezultatów na rozwój nauki, cywilizacji, społeczeństwa
Wykonanie badań przewidzianych w ramach projektu pozwoli na pogłębienie wiedzy na temat molekularnego i funkcjonalnego podłoża genetycznie uwarunkowanych wczesnodzieciecych encefalopatii padaczkowych, w szczególności w kontekście przeniesienia patologii molekularnej na zaburzenia funkcjonalne potencjałozależnego kanału Na+ i ich korelacji z fenotypem.

Celem projektu jest zbadanie ekspresji i charakterystyka właściwości biofizycznych kanałów jonowych Na+ typu NaV1.9 i porównanie tych właściwości w neuronach piramidowych warstwy V kory przedczołowej (PFC) szczurów w różnym wieku. Uważa się, że za zachowanie organizmu oraz zmiany zachowania organizmu związane z wiekiem jest odpowiedzialne prawidłowe funkcjonowanie neuronów PFC. Zaburzone działanie PFC jest przyczyną większości zależnych od wieku chorób neuropsychiatrycznych, które występują u 34% obywateli Unii Europejskiej. Fizjologiczna i patofizjologiczna aktywność neuronów PFC zależy, między innymi, od ekspresji i właściwości biofizycznych kanałów jonowych występujących w tych neuronach. Ostatnio wykazaliśmy, że istotną rolę w regulacji aktywności neuronów PFC mogą odgrywać kanały jonowe TTX-niezależne typu NaV1.9. Badania elektrofizjologiczne zostaną przeprowadzone na neuronach piramidowych warstwy V części przyśrodkowej PFC, zlokalizowanych w skrawkach wyizolowanych od samców szczurów młodych (18-22 dni), w okresie dojrzewania (38-42 dni), dorosłych (60-65 dni) i być może starych (20-miesięcznych). Płaty czołowe zostaną pocięte na skrawki. Neurony piramidowe będą identyfikowane w świetle podczerwonym i DIC. Rejestracje pojedynczych prądów jonowych kanałowych Nav1.9 zostaną przeprowadzone z ciała komórkowego neuronów metodą stabilizacji potencjału na powierzchni łatki. Zostanie określone m. in. prawdopodobieństwo otwarć, średni czas otwarć, amplituda, aktywacja, inaktywacja zależna od potencjału oraz od czasu badanych prądów jonowych kanałowych. Analiza wyników zostanie przeprowadzona za pomocą programu Clampfit 9.0 oraz standardowych testów statystycznych. Neurony zlokalizowane w skrawkach szczurów młodych (18-22 dniowych), w wieku dojrzewania (38-42 dniowych), dorosłych (58-62 dniowych) i starych (20 miesięcznych) otrzymanych z utrwalonych mózgów będą znakowane Map2. Ekspresja kanałów jonowych Nav1.9 zostanie zbadana metodą immunofluorescencji przy wykorzystaniu mikroskopu konfokalnego w neuronach piramidowych identyfikowanych na podstawie kształtu (trójkątny kształt, obecność apikalnego dendrytu, występowanie dendrytów bazalnych). Zostaną porównane właściwości biofizyczne oraz ekspresja kanałów jonowych Nav1.9 u szczurów w różnym wieku. Próg pobudzenia potencjałozależnych kanałów jonowych Na+ typu NaV1.9 jest zbliżony do wartości potencjału błonowego spoczynkowego. W związku z tym zmniejszenie lub zwiększenie prawdopodobieństwa otwarć tych kanałów (wywołane przez związki biologicznie czynne, neuroprzekaźniki) wywołuje, odpowiednio, hiperpolaryzację lub depolaryzację błony komórkowej neuronów i tym samym zmienia pobudliwość neuronów. W neuronach piramidowych występują depolaryzacje potencjału błonowego spoczynkowego. Depolaryzacje te powodują wzrost pobudliwości neuronów będący funkcjonalnym podłożem pamięci operacyjnej. Zaburzenie tych depolaryzacji występuje w padaczce, schizofrenii i w naturalnym lub przyspieszonym starzeniu się ośrodkowego układu nerwowego. Efektor komórkowy odpowiedzialny za powstawanie tych depolaryzacji nie jest zdefiniowany. Wyniki uzyskane w naszej i w innych pracowniach wskazują, że za depolaryzacje neuronów piramidowych PFC może być odpowiedzialna aktywacja kanału Nav1.9. Celem tego projektu jest zarejestrowanie prądów jonowych kanałowych typu Nav1.9 oraz zdefiniowanie ich właściwości biofizycznych w neuronach piramidowych warstwy V PFC szczurów w różnym wieku. Identyfikacja oraz poznanie mechanizmów działania kanałów jonowych Na+ typu NaV1.9 na poziomie komórkowym jest podstawą do zrozumienia mechanizmów odpowiedzialnych za zmiany zachowania organizmu w czasie rozwoju osobniczego oraz do wprowadzenia optymalnej terapii i racjonalnej konstrukcji leków usprawniających i korygujących dysfunkcję aktywności neuronów piramidowych kory przedczołowej.

Celem projektu jest jakościowa i ilościowa analiza związków występujących w owocach aronii czarnoowocowej (Aronia melanocarpa), takich jak antocyjany, procyjanidyny i kwasy hydroksycynamonowe. Ich zawartość zmienia się w trakcie dojrzewania, zależy od czasu zbioru i położenia geograficznego plantacji. Nowością w naszym projekcie jest zastosowanie spektroskopii NMR w połączeniu z metodami chemometrycznymi (analiza głównych składowych PCA, metoda cząstkowych najmniejszych kwadratów PLS) do oznaczania składu ekstraktów i soków. Rezultatem będzie baza danych w postaci parametrów NMR, która pozwoli na analizę profilu metabolitów bez potrzeby rozdzielania mieszaniny. Badane będą również właściwości antyoksydacyjne ekstraktów i soków z aronii, a następnie analizowane przy użyciu chemometrii w celu ustalenia głównych związków odpowiedzialnych za te efekty. Szczególnym ważnym zadaniem będzie badanie, czy wyciągi z aronii lub wybrane związki wykazują działanie przeciwzapalne na komórki śródbłonka, a tym samym posiadają potencjalne właściwości przeciwmiażdżycowe. Dodatkowo zostaną zbadane mechanizmy leżące u podstaw wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych. Dane uzyskane z badania komórek śródbłonka z zastosowaniem chemometrii pozwolą określić związki odpowiedzialne za działanie biologiczne ekstraktów aronii.
Próbki owoców Aronia melanocarpa będą zbierane w ciągu trzech sezonów od lipca do października na przemysłowych, ekologicznych uprawach w Polsce. Owoce zostaną w większości zliofilizowane, częściowo przetworzone na sok. Z liofilizowanych próbek będą wykonane ekstrakty, których skład chemiczny będzie określony za pomocą spektroskopii NMR (1H / 13C NMR w roztworze) z wykorzystaniem analizy chemometrycznej. Znane metody chemometryczne zostały zastosowane i rozwinięte w naszym Zakładzie. Widma NMR będą zarejestrowane się na spektrometrze Bruker 400MHz. Ponieważ widma NMR procyjanidyn w mieszaninie są trudne do interpretacji, potrzebne będzie wsparcie metod chromatograficznych. Analiza jakościowa i ilościowa zostanie przeprowadzona przy użyciu systemu HPLC z detektorem z matrycą diodową (DAD-HPLC), zgodnie z opublikowanymi procedurami. Zakup aparatury HPLC-DAD planowany jest ze środków finansowych projektu. Wszystkie ekstrakty zostaną przebadane pod kątem właściwości antyoksydacyjnych: ORAC, FRAP oraz DPPH i lag-phase przy zastosowaniu spektrometrii EPR. Metoda EPR szczególnie dobrze nadaje się do pomiaru próbek kolorowych (np. ciemnoczerwonych), a także nieprzezroczystych. Widma EPR będą rejestrowane na spektrometrze EPR 9,3 GHz MiniScope (Magnettech). Badania właściwości przeciwzapalnych zostaną przeprowadzone na ludzkich komórkach śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC). Ekspresja cząsteczek adhezyjnych z wykorzystaniem przeciwciał ICAM-1 i VCAM-1 będzie mierzona metodą cytometrii przepływowej. Wydzielanie protein MCP-1 i IL-6, będzie wykonane za pomocą zestawu ELISA. W celu określenia poziomu mRNA dla ICAM, VCAM, MCP-1 i IL-6 zostanie przeprowadzona ilościowa analiza łańcuchowej reakcji polimerazy w czasie rzeczywistym (real-time PCR) na zestawie LightCycler. Będzie również badana generacja wewnątrzkomórkowych reaktywnych form tlenu i rodnika ponadtlenkowego. Zostanie oceniona fosforylacja białek p38 MAPK, ERK1/2, JNK i NF-kB p65 oraz zmierzony poziom białka p65 we frakcji jądrowej za pomocą Trans NF-kB zestaw p65.
Polska ma największy na świecie areał upraw aronii, a konsumpcja tych owoców może przyczynić się do poprawy zdrowia obywateli UE. Nasze badania stanowią wkład w dokumentację oświadczeń zdrowotnych EFSA dla produktów aroniowych, co umożliwi ich promocję jako pro-zdrowotnego produktu. Zastosowanie ekstraktów roślinnych jako żywności, suplementów diety lub leków ziołowych wymaga ich zbadania takimi metodami analitycznymi, które pozwalają na badanie złożonych mieszanin. Takie możliwości zapewnia spektroskopia NMR, zwłaszcza jeśli metabolomika połączona jest z analizą chemometryczną. Wyniki projektu pozwolą na standaryzację produktów aroniowych, takich jak soki czy ekstrakty, przy jednoczesnej optymalizacji ich właściwości antyoksydacyjnych. Jagody aronii charakteryzują się najwyższą wśród owoców aktywnością antyoksydacyjną (wartość ORAC > 160 μmol TE/kg), mogą być cenne w diecie. Standaryzacja ma ogromne znaczenie dla badań in vivo. Rozbieżne wyniki badań klinicznych, to rezultat faktu, że profil związków czynnych różni się w zależności od czasu zbioru, pochodzenia owoców i metod obróbki. Nasze badania pozwolą na lepsze poznanie bioaktywnych związków aronii oraz ich działania antyoksydacyjnego i przeciwzapalnego. Oczekujemy, że preparaty wytworzone w oparciu o nasze wyniki mogą znaleźć stosowanie w profilaktyce miażdżycy i chorób sercowo-naczyniowych.

Kwiat lipy (Tiliae flos) jest popularnym lekiem roślinnym stosowanym w postaci naparów w celu łagodzenia i leczenia objawów przeziębienia, takich jak ból gardła, kaszel czy podwyższona temperatura. Tiliae flos posiada swoją monografię w Farmakopei Europejskiej 8.0, która definiuje tę substancję roślinną jako całe, wysuszone kwiaty pozyskane z lipy szerokolistnej (Tilia platyphyllos L.), drobnolistnej (Tilia cordata Mill.) oraz holenderskiej (Tilia x vulgaris Hayne) bądź będący mieszaniną wymienionych trzech gatunków. Chociaż kwiat lipy uchodzi za dobrze poznany surowiec roślinny, w dostępnym piśmiennictwie nadal brakuje badań dotyczących składu chemicznego oraz aktywności biologicznej wyciągów przygotowywanych z kwiatów pozyskanych z farmakopealnych gatunków lipy. Głównym celem przedstawianego projektu jest kompleksowa analiza fitochemiczna wyciągów przygotowanych z kwiatów lipy zebranych z farmakopealnych gatunków lipy oraz ocena ich aktywności przeciwzapalnej z użyciem modelu ludzkich neutrofili. W trakcie projektu przeprowadzone zostaną porównania składu poszczególnych wyciągów z uwzględnieniem analizy chemometrycznej otrzymanych wyników oraz porównanie aktywności biologicznej badanego materiału pozyskanego z trzech farmakopealnych gatunków lipy (T. platyphyllos, T. cordata, T. x vulgaris) oraz dwóch gatunków nie stanowiących źródła farmakopealnej substancji roślinnej – Tilia americana L. oraz Tilia tomentosa Moench.
Planowane badania zostaną przeprowadzone z użyciem próbek kwiatu lipy zebranych ze stanu naturalnego wiosną/latem 2014, 2015 oraz 2016. Badania będą skupione na próbkach pozyskanych z trzech farmakopealnych gatunków tej rośliny (T. platyphyllos, T. cordata and T. x vulgaris) oraz dwóch niefarmakopealnych gatunków (T. tomentosa and T. americana) wymienianych jako najczęstsze zanieczyszczania tej substancji leczniczej. Komercyjne próbki zawierające kwiat lipy zostaną również zakupione i poddane analizie. Analiza fitochemiczna będzie oparta na nowoczesnych technikach analitycznych, takich jak UHPLC-DAD-MS/MS oraz HPTLC. Obie metody zostaną zoptymalizowane w trakcie prowadzonych badań. Napary przygotowane z wybranych pięciu gatunków lipy zostaną scharakteryzowane pod względem składników w nich występujących na podstawie otrzymanych danych. Wszystkie ekstrakty ze szczególnym uwzględnieniem ekstraktów przeznaczonych do badań biologicznych zostaną poddane standaryzacji z użyciem zwalidowanej metody UHPLC oraz prostszych metod chemicznych celem oznaczenia ilościowego poszczególnych związków i grup związków w nich występujących. Cześć izolacyjna badań fitochemicznych będzie dotyczyła kwiatów otrzymanych z T. cordata. Stosując techniki chromatograficzne takie jak chromatografia kolumnowa, chromatografia typu flash oraz preparatywna HPLC wyizolowane zostaną główne składniki występujące w ekstrakcie przygotowanym z kwiatów T. cordata. Oczyszczone związki zostaną zidentyfikowane z użyciem metod spektroskopowych i spektrometrycznych, takich jak 1D oraz 2D NMR, UV-Vis czy HR-MS. Wyniki badań fitochemicznych zostaną poddane analizie chemometrycznej z użyciem metod statystycznych, takich jak analiza głównych składowych (PCA) czy diagraficzna metoda Czekanowskiego (HCA). Pozwoli to na stwierdzenie różnic w składzie chemicznym pomiędzy naparami otrzymanymi z kwiatów pięciu wybranych gatunków lip oraz określenie czy obserwowane różnice są statystycznie znamienne. W trakcie badań biologicznych oceniony zostanie potencjał przeciwzapalny przygotowanych wyciągów. Określony zostanie wpływ ekstraktów na funkcje prozapalne neutrofili ludzkich, takie jak uwalnianie reaktywnych form tlenu, enzymów proteolitycznych (elastazy, metaloproteinazy z użyciem metod spektrofotometrycznych wykorzystywanych w laboratorium kierownika projektu. Zbadany zostanie również wpływ na produkcję cytokin, takich jak interleukiny-8 oraz 1β stosując gotowe testy ELISA. W toku badań określone zostaną również właściwości przeciwbakteryjne analizowanych ekstraktów. Stosując szczepy bakterii z grupy paciorkowców wyznaczone zostaną minimalne stężenia hamujące wzrost bakterii oraz minimalne stężenia bakteriobójcze.
Proponowany projekt jest skupiony na badaniach podstawowych dotyczących składu chemicznego farmakopealnej substancji roślinnej – Tiliae flos. Otrzymane wyniki przyczynią się do znaczącego poszerzenia dotychczasowej wiedzy na temat składu chemicznego tego leku, wskażą czy istnieją istotne różnice w składzie chemicznym kwiatów pochodzących z pięciu wybranych gatunków tej rośliny. Planowane badania wskażą, jaką metodę standaryzacji należy zastosować w przypadku kwiatu lipy co będzie miało bezpośredni wpływ na podniesienie bezpieczeństwa i skuteczności stosowania naparów z tej substancji roślinnej. Badania biologiczne wykażą czy napary z kwiatu lipy posiadają zdolność do regulowania odpowiedzi zapalnej neutrofili ludzkich oraz zdolność do hamowania rozwoju bakterii z grupy paciorkowców. Wyniki przeprowadzonych badań będą mogły przyczynić się do potwierdzenia zasadności stosowania naparów z kwiatów lipy jako łagodnego środka przeciwzapalnego oraz przeciwbakteryjnego.

W ostatnich latach odkryto, że stosowany w uzależnieniu od etanolu disulfiram (DSF) jest skuteczny w leczeniu uzależnienia od kokainy, za co prawdopodobnie odpowiada blokowanie aktywności beta-hydroksylazy dopaminowej (DBH). Związkiem będącym selektywnym inhibitorem DBH jest nepikastat. Wyniki badań przedklinicznych wskazują, że nepikastat jest także skuteczny w zmniejszaniu objawów zależności kokainowej. Niestety, w piśmiennictwie brak danych na temat wpływu DSF oraz nepikastatu na uzależniające działanie opioidów oraz na rozwój tolerancji, We wstępnych badaniach własnych wykazano, że DSF łagodzi objawy odstawienne po podaniu metadonu (n=IO) i morfiny (n=5) oraz zmniejsza tolerancję na działanie przeciwbólowe tych opioidów. Celem obecnego projektu jest ocena działania DSF oraz nepikastatu na rozwój zależności fizycznej oraz psychicznej po wielokrotnym podawaniu morfiny, a także na rozwój tolerancji na działanie przeciwbólowe morfiny. Planuje się także zbadać mechanizmy biorące udział w działaniu DSF i nepikastatu, ze szczególnym uwzględnieniem roli DBH i receptorów glutaminianergicznych. Postawiono następujące hipotezy badawcze: (1) DSF i nepikastat łagodzą rozwój fizycznej zależności morfinowej; (2) DSF i nepikastat łagodzą rozwój tolerancji na działanie przeciwbólowe morfiny; (3) DSF i nepikastat łagodzą rozwój psychicznej zależności morfinowej; (4) Mechanizm działania DSF i nepikastatu jest związany z jego wpływem na aktywność DBH i/lub receptory glataminianergiczne.
W poszczególnych etapach badań wykorzystane zostaną następujące metody badawcze:
I. Badania zależności fizycznej - ocena objawów zespołu abstynencyjnego. Wpływ DSF i nepikastatu na rozwój zależności fizycznej po podaniu morfiny zostanie zweryfikowany poprzez ocenę stopnia nasilenia objawów zespołu abstynencyjnego, wywołanego podaniem naloksonu.
II. Badanie wpływu DSF i nepikastatu na rozwój tolerancji na działanie przeciwbólowe morfiny w modelach behawioralnych. W celu oceny tolerancji na działanie przeciwbólowe morfiny oraz weryfikacji wpływu badanych substancji na jej rozwój zostanie zastosowany model bólu ostrego. Działanie analgetyczne oceniane będzie przez pomiar progu czucia bodźca mechanicznego wg modyfikacji metody Randall-Selitto, a także pomiar progu czucia bodźca termicznego w teście tail-flick.
III. Badanie właściwości nagradzających i motywacyjnych morfiny oraz nawrotu do jej zachowań poszukiwawczych. W badaniu zostanie wykorzystany model dożylnego samopodawania morfiny. W celu oceny wpływu DSF/nepikastatu na wygaszenie/nawrót zachowań poszukiwawczych w odniesieniu do morfiny, badane związki będą podawane wielokrotnie w okresie odstawienia od morfiny lub jednorazowo (w trzech wybranych dawkach) w fazie nawrotu wywołanego bodźcem bezwarunkowym (morfina) lub warunkowym (światło+dźwięk kojarzone z jej samopodawaniem).
IV. Badania neurochemiczne i molekularne. Dla wyjaśnienia mechanizmów działania DSF i nepikastatu
zastosowane będą procedury neurochemiczne (mikrodializa in vivo i analiza stężeń DA i glutaminianu przy użyciu metody HPLC) oraz molekularne (analiza ekspresji białek receptorów glutaminianergicznych i białka DBH w wybranych strukturach mózgu metodą Western biot).
Wszystkie wymienione wyżej metody stanowią uznane na całym świecie w odnośnych okolicznościach metodyki badawcze.
Proponowane badania prowadzą do generowania nowej wiedzy na temat podłoża molekularnego uzależnień. Zrozumienie mechanizmu działania DSF może być pomocne w tworzeniu nowych leków przeciwko uzależnieniom. Uzależnienie od opioidów nadal stanowi poważny problem medyczny oraz społeczno-ekonomiczny w skali globalnej, zaś skuteczne leki nie są dostępne. Duży rozmiar populacji dotkniętej uzależnieniem od opioidów wraz z niedostatkami terapii prowadzi także do znacznych strat ekonomicznych. Podjęcie planowanych badań jest więc uzasadnione także względami społeczno-ekonomicznymi.

W chorobach neuropsychiatrycznych dochodzi do zaburzenia kontroli aktywności neuronów kory przedczołowej przez małe neuroprzekaźniki: dopaminę, serotoninę, acetylocholinę lub noradrenalinę. Wymienione neuroprzekaźniki aktywują błonowe receptory metabotropowe, które wywołują zmiany spoczynkowych prądów błonowych, a w konsekwencji zmiany aktywności neuronów. Zaburzenie działania tych systemów prowadzi do zmienionej patologicznie aktywności neuronów kory przedczołowej i zaburzenia zachowania organizmu w środowisku. W celu korekty zaburzonej kontroli aktywności neuronów kory przedczołowej przez małe neuroprzekaźniki należy poznać mechanizm ich działania na poziomie komórkowym u zdrowych osobników. Kontrola neuronów kory przedczołowej przez receptory adrenergiczne jest stosunkowo mało poznana. Uważa się, że przekazywanie sygnału w neuronach kory przedczołowej od receptorów adrenergicznych do elektorów komórkowych (kanałów jonowych) jest zaburzone między innymi w zespole stresu pourazowego, schizofrenii, zaburzeniach nastroju oraz zaburzeniach lękowych. Występowanie tych patologii zależy od wieku osobnika. Celem projektu jest zbadanie mechanizmów odpowiedzialnych za kontrolę spoczynkowych prądów błonowych w neuronach piramidowych kory przedczołowej przez receptory adrenergiczne.
W szczególności zamierzam zbadać:
• Jakie podtypy błonowych receptorów adrenergicznych są odpowiedzialne za zmianę spoczynkowych prądów błonowych w neuronach piramidowych?
• Jakie podtypy kanałów jonowych (efektorów komórkowych) odpowiedzialnych za spoczynkowe prądy błonowe są kontrolowane przez receptory adrenergiczne?
• Które wtórne przekaźniki błonowe i/lub cytoplazmatyczne pośredniczą w przekazywaniu sygnału od receptorów adrenergicznych do kanałów jonowych?
• Czy kontrola spoczynkowych prądów błonowych przez receptory adrenergiczne jest odmienna u szczurów młodych, w wieku dojrzewania i dorosłych?
Celem projektu jest zbadanie mechanizmów odpowiedzialnych za kontrolę spoczynkowych prądów błonowych w neuronach piramidowych kory przedczołowej przez receptory adrenergiczne. Prądy błonowe będą rejestrowane w skrawkach z neuronów piramidowych warstwy V kory przedczołowej. Skrawki będą pobierane z części przyśrodkowej kory przedczołowej szczurów młodych (20-dniowych), w wieku dojrzewania (40-dniowych) i dorosłych (60-dniowych). Rejestracje prądów zostaną wykonane metodą perforowanych łatek w temperaturze 34°C z wykorzystaniem gramicydyny rozpuszczonej w płynie w pipecie. Jeśli będzie to konieczne, prądy błonowe zostaną zarejestrowane z neuronów rozproszonych z zastosowaniem klasycznej metody stabilizacji potencjału na całej powierzchni błony komórkowe (whole-cell vollagc-clamp). Agoniści receptorów adrenergicznych, blokery efektorów komórkowych i systemu transdukcji sygnału wewnątrzkomórkowego inne będą dodawane do komory rejestracyjnej lub do płynu w pipecie. Analizowany będzie wpływ tych związków na spoczynkowe prądy błonowe. W swoich badaniach określę proces przekazywania sygnału od receptorów adrenergicznych do efektorów komórkowych w neuronach piramidowych kory przedczołowej. Badania te są istotne, ponieważ: a. zaburzona funkcja na jednym z etapów przekazywania sygnału może prowadzić do rozwoju chorób neuropsychiatrycznych oraz b. wszystkie elementy szlaku przekazywania sygnału są potencjalnym punktem uchwytu do działania dla substancji biologicznie czynnych podawanych w celu przywrócenia prawidłowej funkcji neuronów.

Jednym z głównych problemów współczesnej medycyny jest narastające zjawisko oporności mikroorganizmów będące wynikiem niekontrolowanego stosowania antybiotykoterapii Corocznie w krajach Unii Europejskiej umiera z powodu iniekcji wywołanych bakteriami opornymi na antybiotyki ok. 25 000 osób. Celem projektu są badania nad syntezą, właściwościami fizykochemicznymi i biologicznymi wielkocząsteczkowych nośników peptydów przeciwdrobnoustrojowych. Określony zostanie wpływ topologii matryc polimerowych, zawartości i dystrybucji AMPs związanych z matrycą na efektywność układów polimer-peptyd. Ponadto określona zostanie kinetyka uwalniania substancji aktywniej z matryc polimerowych oraz skuteczność działania nowych układów w testach mikrobiologicznych. Matryce polimerowe będą otrzymywane w wyniku polimeryzacji z otwarciem pierścienia cyklicznych monomerów (ROP) wobec wybranych biokalalizalorów (lipaz). Otwarcie pierścienia omija etap generowania grup odchodzących, który może ograniczać szybkość propagacji i ciężar cząsteczkowy produktu. Zastosowanie enzymów w procesie polimeryzacji pozwoli uniknąć toksycznych pozostałości po klasycznych katalizatorach metaloorganicznych. Synteza matryc polimerowych będzie prowadzona w rozpuszczalnikach organicznych. Jak pokazują wyniki badań eksperymentalnych, pozwala to na wyższą niż w środowisku wodnym enancjoseleklywność oraz termostabilność lipaz. Jako medium reakcyjne ze względu na niską prężność par, wysoką stabilność termiczną i chemiczną, zostaną wytypowane ciecze jonowe (ILs). Lipazy w środowisku cieczy jonowych (o określonej strukturze) wykazują wyższą niż tradycyjnych rozpuszczalnikach organicznych aktywność i selektywność. Po zakończonym procesie produkty reakcji będzie można w łatwy sposób odseparować np. poprzez ekstrakcję. Synteza nośników będzie prowadzona w reaktorze klasycznym i mikrofalowym. Stosowanie promieniowania mikrofalowego ma wiele zalet: jest to proces przyjazny środowisku, ponieważ pozwala znacznie przyspieszyć czas trwania reakcji, zachowując przy tym kontrolę nad jej przebiegiem. Do przygotowanych matryc polimerowych będą przyłączane peptydy m.in. na drodze estryfikacji grup funkcyjnych peptydów i otrzymanych polimerów oraz na drodze poliaddycji przy użyciu alifatycznych i cykloalifatycznych diizocyjanianów. W projekcie zostaną zastosowane komercyjnie dostępne peptydy oraz nowe, syntetyczne analogi peptydów, m.in. eitropina 1.l. protegryna 1, teporyna A. amiganan MDI 226, pexiganan MSI 78 syntetyzowane przy współpracy (jak w dotychczasowych badaniach) z Gdańskim Uniwersytetem Medycznym. Peptydy będą syntetyzowane metodą Fmoc w reaktorze mikrofalowym na nośniku polistyrenowym (żywica polistyrenowa modyfikowana linkerem Rink-amidowym) Struktura otrzymanych, wielkocząteczkowych koniugatów peptydów antydrobnoustrojowych, będzie określana za pomocą szeregu metod instrumentalnych: 1H i 13C, CP/MAS, UV-Vis, ET1R, GPC, SEM a właściwości termiczne za pomocą DSC-TG. W zależności od struktury koniugatu i zawartości substancji aktywnej określona zostanie zdolność i szybkość degradacji hydrolitycznej w roztworach buforowych oraz biodegradacja w obecności hydrolaz. Skuteczność wytworzonych, nowych układów nośnik-AMP będzie badana w testach mikrobiologicznych. Biozgodność, cytotoksyczność i genotoksyczność będzie weryfikowana w warunkach in vitro za pomocą szybkich testów diagnostycznych. W projekcie zostanie zweryfikowana skuteczność i możliwość zastosowania wytworzonych matryc jako nośników peptydów przeciwdrobnoustrojowych. Zostanie wykazana zależność pomiędzy strukturą otrzymanych biomateriałów' a kinetyką uwalniania substancji aktywnej. W dalszej perspektywie rezultaty projektu mogą przyczynić się do rozwoju badań o charakterze aplikacyjnym w walec z lekoopornością mikroorganizmów' Projekt jest interdyscyplinarny i rezultaty otrzymane po jego zakończeniu mogą wnieść znaczący udział w rozwój chemii medycznej, chemii farmaceutycznej, chemii biomateriałów i farmacji.

Celem projektu będzie synteza i określenie aktywności biologicznej nowych pochodnych pirydo [1,2-c] pirymidyny, związków o podwójnej wiązalności do 5-HT1AR oraz SERT. Wyniki badań biologicznych in vitro i in vivo pozwolą na ocenę wpływu dokonanych modyfikacji struktury związków na ich aktywność biologiczną. Przesłanką badań jest otrzymanie nowego antydepresanta III generacji z grupy SSRI + lub MTA (Multi Target Agents). Prowadzone badania nad obiema grupami (SSRI + , MTA) należą do wiodących kierunków badań chemii medycznej nad nowym lekiem przeciwdepresyjnym, a w przypadku poszukiwań w grupie MTA - do badań pionierskich. W realizacji celu badań wykorzystana będzie wiedza z zakresu chemii medycznej, fizykochemii, farmakokinetyki, farmakologii oraz badań in silico, którą dysponuje zespół realizujący projekt.
Realizacja celu badań projektu oparta będzie o następującą metodykę:
- zaprojektowanie struktur ligandów w oparciu o analogie strukturalne ze znanymi ligandami o wiązalności do 5-HT1AR lub SERT, modyfikacje struktur wiodących oraz wstępne wyniki modelowania molekularnego
- otrzymanie na drodze wieloetapowej syntezy chemicznej wyjściowych syntonów do otrzymania związków finalnych; synteza związków finalnych zaplanowanych w projekcie w pięciu niezależnych szeregach (planowana jest synteza ponad 60 nowych związków);
- przygotowanie próbek analitycznych do badań fizykochemicznych i biologicznych oraz ocena ich czystości (HPLC);
- potwierdzenie struktury chemicznej (metodami spektroskopii IR, NMR) i składu (analiza elementarna oraz spektrometria HRMS), prowadzona dla wszystkich związków finalnych;
- badanie in vitro powinowactwa do 5-HT1AR i SERT przy użyciu odpowiednich radioligandów (dla wszystkich związków finalnych);
- badania radioreceptorowe in vitro w poszerzonym profilu receptorowym (5-HT2A, 5-HT2c, 5-HT6, 5-HT7, α i D2) dla ligandów wykazujących najwyższe powinowactwo do jednego z celów molekularnych 5-HT1AR lub SERT,
- badanie in vivo aktywności funkcjonalnej wobec pre- i postsynaptycznych receptorów 5-HT1A (test indukowanej hipotermii u muszy i test LLR u szczurów);
- badanie trwałości w fazie I przejścia dla wybranych ligandów z obu szeregów (badanie ADME);
- badanie aktywności przeciwdepresyjnej dla związków wykazujących najwyższe wiązalności do 5-HT1AR i SERT oraz posiadających największą trwałość w fazie I przejścia (test Porsolta i test ruchliwości);
- badanie in silico dla ligandów obu szeregów (dokowanie molekularne, SAR);
- analiza SAR dla wszystkich przebadanych związków;
optymalizacja struktury w oparciu o analizę SAR, ADME oraz badania in silico, która może w istotny sposób wpłynąć na efektywne poszukiwanie struktury wiodącej w badaniach nad nowymi antydepresantami z grupy SSRI i lub MTA.
Prowadzona w ramach projektu synteza wniesie wkład w wiedzę z zakresu chemii medycznej związków heterocyklicznych wykazujących aktywnością biologiczną. Obiecujące wyniki wcześniejszych badań nad pochodnymi pirydo[1,2-c]pirymidyny wskazują na duże prawdopodobieństwo otrzymania ligandów o wysokim powinowactwie do 5-HT1AR oraz SERT, co może prowadzić do uzyskania skutecznego nowego leku przeciwdepresyjnego III-generacji z grupy SSRI. Natomiast planowane badania nad ligandami z grupy MTA mogą prowadzić do antydepresanta o nowym mechanizmie działania, skróconym okresie latencji i większej skuteczności w porównaniu z najczęściej stosowanymi w farmakoterapii depresji lekami Il-giej generacji z grupy SSRI. Wyniki badań biologicznych przewidzianych w projekcie pozwolą na wyznaczenie wpływu dokonanych modyfikacji struktury ligandów na wiązalność do 5-HT|AR i SERT, optymalizację struktury wiodącej prowadzącej do uzyskania nowych związków o aktywności przeciwdepresyjnej w grupie SSRH lub MTA.