Narodowe Centrum Nauki

Choroby nowotworowe stanowią ważny, wciąż nierozwiązany problem medycyny klinicznej i farmakologii XXI wieku. Dlatego też prowadzone są intensywne badania nad opracowaniem nowych leków przeciwnowotworowych, specyficznie niszczących komórki nowotworowe, a nie wywołujących negatywnych skutków ubocznych i o polepszonych parametrach farmakokinetycznych. W Laboratorium Przesiewowym Związków Przeciwnowotworowych działającym w Zakładzie Chemii Bioorganicznej Centrum Badań Molekularnych i Makromolekularnych PAN w Łodzi odkryto interesujące właściwości cytotoksyczne kilku związków z grupy benzo[b]furanów i dikarboksyimidów zaprojektowanych i wytworzonych w Zakładzie Chemii Medycznej Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego. Związki te okazały się cytotoksyczne w stosunku do komórek białaczek CML (K562), ALL (MOLT-4) i AML (HL-60), natomiast są nietoksyczne dla prawidłowych komórek śródbłonka (HUVEC) oraz nowotworowych komórek adherentnych (HeLa i CFPAC). Związki te i ich aktywność przeciwnowotworowa zostały ochronione patentami polskimi i międzynarodowymi (EP13150611.5-1452, EP13176421.9, P.398193, P.400000)
Cel badań: Przeprowadzenie zaawansowanych badań przedklinicznych dla wybranych pochodnych benzo[b]furanów i dikarboksyimidów jako potencjalnych związków przeciwbiałaczkowych, w tym zbadanie ich aktywności wobec hematopoetycznych komórek macierzystych pobranych od pacjentów z AML i CML i in vivo, w modelach zwierzęcych oraz poznanie molekularnego mechanizmu działania tych związków w komórkach.

Cel prowadzonych badań/hipoteza badawcza: Nowotwory tarczycy stanowią najczęstszą grupę nowotworów endokrynnych, a ich liczba stale wzrasta. Najczęstszym, stanowiącym 85% ogółu, jest rak brodawkowaty tarczycy (PTC). Podstawą jego leczenia jest chirurgiczna resekcja tarczycy wraz z regionalnymi węzłami chłonnymi oraz terapia uzupełniająca polegająca na podaniu promieniotwórczego jodu 1131. Część pacjentów jest jednak oporna na terapię jodem radioaktywnym. Wobec ograniczonej skuteczności innych form leczenia, m. in. teleradioterapii, chemioterapii, chorzy ci umierają z powodu agresywnego przebiegu choroby. Stąd też konieczne jest poszukiwanie nowych terapii.
Produkt białkowy genu SLC5A8 został pierwotnie zidentyfikowany jako transporter jodkowy obecny w błonie szczytowej tyreocytów i z tego powodu nazwany AIT (ang. Apical Iodide Transporter) Jest też supresorem nowotworzenia, a jego ekspresja jest obniżona w wielu nowotworach, w tym w PTC Najwięcej badań dotyczących jego funkcji supresorowej dotyczy jelita grubego i opiera się na zdolności AIT do transportu krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych Tylko kilka prac wspomina o modulacji przez SLC5A8 innych genów zaangażowanych w proces nowotworzenia, a są to geny tak fundamentalne jak TP53, FASL, FASR, Bcl-2, TRAIL, TRAILR1 i 2, BIRC5 Zaskakujące jest zatem, że nikt nie przeprowadził zmian wywoływanych przez nadekspresję SLCSA8 na poziomie całego transkryptomu. Istnieją jedynie nieliczne badania nad regulacją ekspresji SLC5A8, co skierowało naszą uwagę na rolę mikroRNA w tym procesie MikroRNA (miRNA) to około 22 nukleotydowe niekodujące cząsteczki RNA, które hamują ekspresję genów poprzez wiązanie z komplementarną sekwencją w ich transkryptach, W wykonanych przez nas badaniach wstępnych wykazaliśmy, że miR-181a-5p, -182-5p i -494 regulują ekspresję SLC5A8, a ich podwyższony poziom w PTC może prowadzić do obniżenia ekspresji SLCSA8. Wykazaliśmy także wpływ mikroRNA na proces transportu jodu radioaktywnego. Zmiany w ekspresji mikroRNA można modulować poprzez specyficzne inhibitory, dlatego też potwierdziliśmy, że transfekcja syntetycznym inhibitorem miR-181a-5p zwiększa ekspresję mRNA SLC5A8 i postawiliśmy hipotezę, że hamując aktywność zidentyfikowanych mikroRNA spowodujemy zwiększenie ekspresji SLC5A8. co doprowadzi do zwiększonej akumulacji jodu radioaktywnego oraz do zmiany poziomu genów regulowanych przez SLC5A8, co może zwiększyć skuteczność terapii przeciwnowotworowych.
Celem projektu jest wykorzystanie specyficznych inhibitorów mikroRNA do przywrócenia właściwego poziomu SLC5A8 w komórkach wyprowadzonych z raka tarczycy. Przeprowadzimy podwójną analizę wpływu podwyższonej ekspresji SLC5A8 na fizjologię komórek: za pomocą sekwencjonowania nowej generacji określimy całkowity transkryptom linii komórkowych, w których zahamowane zostanie działanie wybranych mikroRNA (analiza potencjalnej cytotoksyczności inhibitorów). Następnie zbadamy całkowity transkryptom linii komórkowych, w których przeprowadzimy nadekspresję genu SLCSA8 (analiza roli SLC5A8 w regulacji ekspresji genów). Dzięki tej analizie zidentyfikujemy szlaki, w których SLC5A8 wywiera swoją rolę supresorową. MiR-181a-5p, -182-5p i -494-3p ulegają nadekspresji także w innych nowotworach, możemy zatem nazywać je onkomiRami. Tym bardziej uzasadnione jest zbadanie wpływu ich inhibicji na zmiany zachodzące na poziomie całego transkryptomu. Następnym krokiem będzie porównanie zmian w ekspresji genów wywołanych nadekspresją SLC5A8 oraz inhibicją mikroRNA. Nie tylko dostarczy to listy genów docelowych, ale także przybliży nas do odpowiedzi na pytanie, czy tkankowospecyficzna inhibicja tych mikroRNA mogłaby w przyszłości znaleźć zastosowanie terapeutyczne. Zastosowana metoda badawcza/metodyka: Podczas realizacji projektu stworzymy plazmid wyrażający sekwencję kodującą genu SLC5A8 oraz tzw. sponge dla miR-181a-5p, -182-5p i -494, wyrażający transkrypt o sekwencji komplementarnej do 3 mikroRNA, działający jako specyficzny inhibitor tych cząsteczek.. Optymalne warunki transfekcji określimy mierząc ekspresję SLC5A8 oraz co najmniej jednego z jego opisanych genów docelowych za pomocą PCR czasu rzeczywistego. Po określeniu optymalnego protokołu z komórek wyizolujemy RNA, przygotujemy bibliotekę cDNA i poddamy sekwencjonowaniu nowej generacji (NGS). Stworzymy listy genów o ekspresji zmienionej pod wpływem nadekspresji SLC5A8 oraz (osobno) wyciszenia mikroRNA. Następnie porównamy ze sobą te listy, celem określenia zmian wywołanych nadekspresją genu, zmian wywołanych przez wyciszenie wybranych mikroRNA, a w konsekwencji określimy potencjalną użyteczności inhibitorów mikroRNA w przywracaniu ekspresji SLC5A8 w raku PTC. Wpływ spodziewanych rezultatów na rozwój nauki, cywilizacji, społeczeństwa: Będzie to pierwszy projekt w ramach którego zostanie scharakteryzowany wpływ SLC5A8 na ekspresję innych genów na poziomie całego transkryptomu. Określimy także możliwości przywrócenia jego ekspresji za pomocą inhibicji mikroRNA. Co istotne, dzięki zastosowaniu techniki NGS wskażemy użyteczne z terapeutycznego punktu widzenia inne geny docelowe dla tych mikroRNA. Porównamy zmiany wywołane nadekspresją genu SLC5A8 z wywołanymi przez wyciszenie wybranych przez nas mikroRNA, które regulują także inne geny docelowe, w tym zaangażowane w supresję nowotworzenia. Dzięki temu określimy potencjalną użyteczność wyciszania wybranych mikroRNA u pacjentów cierpiących na raka brodawkowatego tarczycy.

Komórki nabłonkowe jelita stanowią pojedynczą warstwę nabłonka, która formuje barierę oddzielającą zawartość światła jelita od komórek immunokompetentnych układu GALT Nabłonek jelitowy jest obecnie uważany za ważną część układu immunologicznego jelita niezbędną w indukcji i regulacji zarówno nieswoistych, jak i swoistych odpowiedzi immunologicznych w błonie śluzowej jelita. Zaburzenia funkcji immunologicznych komórek nabłonkowych mogą przyczyniać się do rozwoju nieswoistych zapaleń jelita (NZJ) oraz alergii pokarmowych. Głównym celem projektu jest ocena oddziaływań bakteriofagów (wirusów bakteryjnych) na funkcje immunologiczne nabłonka jelitowego in vitro.
Zastosowana metoda badawcza/metodyka
Wszystkie doświadczenia będą przeprowadzone na linii komórkowej Caco-2. W pierwszym etapie badania oceniony będzie wpływ bakteriofagów na ekspresję wybranych genów ważnych dla funkcji immunologicznych nabłonka jelitowego. Ekspresja genów oceniana będzie przy użyciu zestawu RT2 Profiler PCR Assay. Istotne indukowane przez bakteriofagi zmiany w ekspresji genów będą weryfikowane przez zmierzenie produkcji odpowiednich białek metodą ELISA (dla białek rozpuszczalnych) lub cytometrią przepływową (dla białek błonowych).
Wpływ spodziewanych rezultatów na rozwój nauki, cywilizacji, społeczeństwa
Zgodnie z nasza wiedzą, jest to pierwsze badanie oceniające wpływ bakteriofagów na funkcje immunologiczne nabłonka jelitowego. Realizacja projektu poszerzy wiedzę o roli mikroflory jelitowej w regulacji homeostazy immunologicznej w błonie śluzowej jelita oraz patogenezy NZJ i alergii pokarmowych.

Astma i przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP) to najczęstsze przewlekłe choroby układu oddechowego w naszym społeczeństwie. Ich istotą jest zapalenie w obrębie dolnych dróg oddechowych, które prowadzi do obturacji (zwężenia) oskrzeli. Do głównych objawów astmy i POChP należą duszność, świsty słyszalne podczas oddychania, kaszel (suchy lub z wykrztuszaniem), pogorszenie tolerancji wysiłku. Ujawnienie się choroby zależy zarówno od predyspozycji genetycznych jak również od czynników środowiskowych, takich, jak alergeny, które sprzyjają rozwojowi astmy oraz dym tytoniowy, który stanowi najważniejszą przyczynę POChP. Zarówno astma, jak i POChP są chorobami bardzo złożonymi i cechującymi się zmiennym przebiegiem. Diagnostyka astmy i POChP bywa utrudniona, ponieważ choroby te mają czasami dość podobne objawy. W praktyce astma i POChP to często dwa zbiory chorób układu oddechowego, których patofizjologia, objawy kliniczne i leczenie w znacznym stopniu pokrywają się. Jednym z najważniejszych zjawisk odgrywających rolę w rozwoju i przebiegu tych chorób jest napływ do dróg oddechowych różnych komórek zapalnych. Obecność i aktywność określonych grup komórek w drogach oddechowych jest ściśle związana z powstawaniem objawów choroby. Komórkami typowymi dla astmy są granulocyty kwasochłonne (eozynofile), a w POChP dominującą rolę odgrywają granulocyty obojętnochłonne (neutrofile). Jednak ten klasyczny obraz zapalenia w drogach oddechowych przypisywany astmie lub POChP jest często trudny do zaobserwowania, gdyż istnieje wiele fenotypów mieszanych i nakładających się. Stała obecność zwiększonej liczby eozynofilów i neutrofilów w płucach prowadzi do rozpadu tych komórek i uwalniania się z nich szkodliwych przekaźników powodujących uszkodzenie dróg oddechowych, co prowadzi do powstawania objawów choroby. W efekcie obserwuje się produkcję dużej ilości wydzieliny i podrażnienie zakończeń nerwowych. Dla chorego oznacza to kaszel, duszność, gorsze wyniki testów oddechowych oraz konieczność częstych wizyt u lekarza związanych z infekcjami układu oddechowego.
Komórki w drogach oddechowych mają zdolność porozumiewania się dzięki ogromnej ilości przekaźników które produkują. Ważnymi białkami kształtującymi opowiedz alergiczną organizmu są cytokiny produkowane przez nabłonek: TSLP, IL-33 i IL-25. Dzięki tym cytokinom możliwa jest „rozmowa” pomiędzy grupami komórek które bezpośrednio tworzą stan zapalny w drogach oddechowych. Rola TSLP, IL-33 oraz IL-25 jest szeroko badana w astmie jako chorobie mającej często podłoże alergiczne. Znaczenie i funkcja tych cytokin w POChP nie jest znana. Atopia, czyli genetycznie uwarunkowany zespół zaburzeń układu odpornościowego wynikający z reakcji organizmu na dany alergen, przebiega z udziałem TSLP, IL-33 oraz IL-25. W świetle ostatnich publikacji naukowych które kładą nacisk na indywidualizację rozpoznawania i leczenia chorób obturacyjnych układu oddechowego, ważne jest poznanie podłoża reakcji biologicznych zapalenia alergicznego, które może występować zarówno w astmie jak i POChP aszczególnie w POChP z fenotypem alergicznym (eozynofilowe zapalenie w POChP).
Prezentowany projekt ma na celu ocenę interakcji i zależności między typami komórek tworzącymi odpowiedz immunologiczną układu oddechowego: makrofagami, nabłonkiem oddechowym i komórkami dendrytycznymi na drodze ekspresji TSLP, IL-33 i IL-25 w atopowych i nieatopowych obturacyjnych chorobach układu oddechowego. Projekt ma być realizowany w złożonym (trójwarstwowym) i zaawansowanym modelu in vitro, który odzwierciedla miej sce aktywnej odpowiedzi immunologicznej w drogach oddechowych człowieka. Materiał do badania będą stanowił nabłonek oddechowy izolowany z wymazów szczoteczkowych nosa, oraz makrofagi i komórki dendrytyczne izolowane z komórek krwi obwodowej od chorych na POChP, astmę oraz osób zdrowych.
Dokładna analiza reakcji biochemicznych leżących u podstaw zapalenia alergicznego u pacjentów z astmą i POChP pozwoli na poszerzenie wiedzy w dziedzinie immunologii oraz umożliwi lepsze zrozumienie mechanizmów sterujących przebiegiem obturacyjnych chorób układu oddechowego.

Projekt badania zawiera osiem hipotez badawczych i 8 odpowiadających im celów badania. Najważniejsze cele przedstawiono poniżej.
• Analiza zmian wskaźników wentylacyjnych płuc oraz zmian wskaźników wymiany gazowej w zależności od objętości usuniętego płynu i zmian ciśnienia wewnątrzopłucnowego.
• Badanie zmian podatności płuc i ścian klatki piersiowej oraz związanych z nimi zmian w zakresie pracy oddechowej zachodzących podczas terapeutycznej punkcji opłucnej i ewakuacji płynu.
• Analiza związku pomiędzy zmianami ciśnienia śródopłucnowego, wymiarami i czynnością serca ocenianymi na podstawie badania echokardiograficznego oraz zmianami stężenia we krwi peptydu natriuretycznego typu A i peptydu natriuretycznego typu B.
• Porównawcza analiza możliwości przewidywania przebiegu krzywej objętość-ciśnienie na podstawie zmiennych zmierzonych przed zabiegiem oraz rzeczywistych pomiarów ciśnienia i wentylacji dokonanych podczas zabiegu.
Badanie zostanie przeprowadzone u 60 chorych z płynem w jamie opłucnej wymagających terapeutycznej punkcji opłucnej.
Badania przed toracentezą. bodypletyzmografia, spirometria, zdolność dyfuzyjna dla tlenku węgla (DLCO), badanie gazów krwi tętniczej, sześciominutowy test chodu, echokardiografia, stężenie peptydów natriuretycznych we krwi.
Ocena w czasie toracentezy: stały pomiar objętości oddechowej i częstości oddychania, pomiar objętości płynu usuwanego z opłucnej, pomiar ciśnienia w jamie opłucnej, przezskórne monitorowanie ciśnienia parcjalnego 02 i C02.
W jamie opłucnej pozostanie cewnik umożliwiający drenaż płynu i okresowy pomiar ciśnienia wewnątrzopłucnowego po zakończeniu zabiegu.
Monitorowanie w czasie 48 godzin po zabiegu. W dwóch grupach chorych (poddanych fizjoterapii mającej na celu przyśpieszenie upowietrzenia płuca i tych, u których fizjoterapia nie będzie stosowana) zostaną w odpowiednich odstępach czasowych powtórzone badania sprzed punkcji opłucnej. Pomiary ciśnienia w opłucnej będą prowadzone do 48 godzin po zabiegu. Następnie, cewnik zostanie usunięty.
Analiza. Przeprowadzona za pomocą własnych programów komputerowych, analiza sygnałów oraz wizualna wielowymiarowa analiza relacji między parametrami stanowić będzie wstęp do formułowania hipotez fizjologicznych, medycznych oraz statystycznych, a także będzie sugerować ewentualne modyfikacje analizy i dokonanej wcześniej parametryzacji sygnałów.
Wyniki badania pozwolą na scharakteryzowanie zależności między wskaźnikami czynności płuc, wskaźnikami wymiany gazowej i funkcją serca a zmianami ciśnienia śródopłucnowego. Niektóre z badanych zależności nie były nigdy wcześniej przedmiotem badań. Wyniki badania mogą wpłynąć na zmianę standardu postępowania podczas terapeutycznej punkcji opłucnej i we wczesnym okresie po jej wykonaniu.

Pasożyty z rodzaju Trypanosoma (Świdrowce) cechują się unikalną fizjologią komórkową, ponieważ przeprowadzają istotne procesy glikolityczne i peroxysomalne w jednym organellum, glikosomie. Ponieważ glikosomy nie zawierają informacji genetycznej, wszystkie enzymy aktywne w tym kompartmencie muszą być tam dostarczane posttranslacyjnie. Grupa enzymów zwanych peroksynami (małe białka peroksysomalne, PEX#) zawiadują tym transportem. Spośród nich, PEX5 oraz PEX14 pełnią ważną rolę w tym szlaku biochemicznym, ponieważ wytworzenie kompleksu między nimi jest niezbędne do zaimportowania białek z macierzy komórkowej do glikosomu. Z tego względu postuluje się iż niedopuszczenie do wytworzenia tego kompleksu, np. za pomocą małocząsteczkowej substancji lekopodobnej mogło by być interesującą strategią walki z chorobami powodowanymi przez Świdrowce, jak również metodą poznawania procesów biochemicznych zachodzących w glikosomach. Interakcje międzybiałkowe należą do celów molekularnych szczególnie trudnych. Tak jak w przypadku wielu innych interakcji międzybiałkowych, oddziaływanie PEX14 z PEX5 jest głównie natury hydrofobowej i aromatycznej, z zaledwie dwoma płytkimi, eksponowanymi kieszeniami wiążącymi zlokalizowanymi na dużej powierzchni kontaktu. W rezultacie, aby być zdolną do konkurowania o miejsca wiążące na powierzchni PEX14, ‘konwencjonalna’, ‘lekopodobna’ cząsteczka chemiczna musiała by mieć ściśle lipofilowy charakter. To z kolei implikuje trudności z zachowaniem parametrów farmakochemicznych w pożądanych zakresach. Z tego względu istnieje konieczność poszukiwania strategii alternatywnych inhibicji tego trudnego celu molekularnego, innych niż ‘klasyczne’ małocząsteczkowe związki chemiczne. Celem tego projektu jest próba wykorzystania mimetyków alfa helisy, pochodnych oksopiperazyny, jako nowych inhibitorów interakcji białek PEX14 i PEX5 o wysokiej skuteczności przeciwpasożytniczej i odpowiednich właściwościach farmakochemicznych. Multidyscyplinarne podejście do tego realizacji tego celu będzie opierać się na takich metodach badawczych jak synteza chemiczna, komputerowe projektowanie ligandów w oparciu o strukturę białka, jak również na oznaczeniach biofizycznych i komórkowych. Wnioski wyciągnięte z tych badań mogą być ważne nie tylko dla projektowania przyszłych potencjalnych leków przeciw chorobom tropikalnym, lecz także powinny przysłużyć się lepszemu zrozumieniu procesów biochemicznych zachodzących w glikosomach.

Projekt zakłada otrzymanie serii nowych związków chemicznych, pochodnych hydroksykumaryn, o wysokim powinowactwie do receptorów serotoninergicznych i transportera serotoniny. Związki zaprojektowano w oparciu o przegląd literaturowy i przy użyciu metod modelowania molekularnego. Struktury związków zostały zaplanowane w oparciu o dotychczasowe badania w których otrzymano pilotażowe serie arylopiperazynylopropoksylowych i butoksylowych pochodnych 8- acetylo-7-hydrosky-4-metylokumaryny, określono ich profil działania i powinowactwo do niektórych receptorów serotoninergicznych. Wstępne wyniki są optymistyczne i zachęcają do dalszych badań. Ustalono, że wprowadzenie grupy acetylowej w pozycję 8 pierścienia kumaryny przyczyniło się do znacznego wzrostu powinowactwa do receptora 5-HT1A ( Ki= 89,2 nM dla związku bez grupy acetylowej do Ki=0,8 nM dla 8- acetylo-7-{4-[4-(3-metoksyfenylo)-1 -piperazynylo]butoksy}-4-metylokumaryny). Ponadto, dzięki dokowaniu molekularnemu ustalono, że związki tego typu są stabilizowane w kieszeni receptora głownie przez wiązanie wodorowe między Ser190 i grupą acetylową kumaryny. Wiązanie to było już wcześniej opisywane jako ważne w wiązaniu ligandów (innych niż kumarynowe) do receptora 5-HT1A. Znaczenie ma także podstawienie pozycji 4 w pierścieniu kumaryny grupą metylową oraz oczywiście dobór odpowiedniego łącznika i pochodnych arylopiperazyny zawierających podstawniki w pozycji orto lub orto/meta pierścienia fenylowego. Opierając się na powyższych danych zdecydowałam się na syntezę nowych arylopiperazynylowych pochodnych hydroksykumaryn z zastosowaniem trój/cztero/piecio i sześciowęglowego linkera oraz szeregu amin. Syntezy organiczna bazuje na pewnych i sprawdzonych reakcjach chemicznych. Związki, zaplanowane, w ramach projektu, będą otrzymane w wyniku kilkuetapowych syntez organicznych, w większości z zastosowaniem reaktora mikrofalowego. Pochodne będą oczyszczane metodami krystalizacji bądź chromatografii kolumnowej, a ich struktury potwierdzone za pomocą widm 'H NMR, l3C NMR, MS, oraz metodami krystalograficznymi dla wybranych cząsteczek.
Podstawowym rezultatem przedstawionego projektu będzie otrzymanie oczyszczenie i potwierdzenie struktur zaplanowanych związków chemicznych o spodziewanej aktywności farmakologicznej. Rezultaty zostaną opublikowane w międzynarodowych czasopismach. Przewidujemy otrzymanie arylopiperazynylowych pochodnych 8-acetylo-7-hydrosky-4-metylokumaryny i 6-acetyIo-5-hydroksy-4,7-dimetylokumaryny, zawierających grupę acetylową w pozycji orto względem grupy hydroksylowej w kumarynie. Arylopiperazynylowe pochodne 5-hydroksykumaryny nigdy dotąd nie były opisane w literaturze naukowej, ani badane pod kątem powinowactwa do receptorów serotoninowych. Projekt pozwoli wzbogacić bibliotekę pochodnych kumaryn o nowe pochodne a uzyskane wyniki będą składały się na materiał rozprawy habilitacyjnej kierownika projektu. Ponieważ projekt wpisuje się w ramy chemii medycznej, konieczne będą badani a farmakologiczne (poza przedstawionym wnioskiem). Powinowactwo do receptorów serotoninergicznych i transportera serotoniny zostaną okrślone w oparciu o badania in vitro (w ramach współpracy naukowej z Katedrą Farmakobiologii Wydziału Farmaceutycznego Uniwersytetu Jagiellońskiego).

Przedmiotem moich zainteresowań naukowych są polimery ze śladem molekularnym (ang. molecularly imprinted polymers, MIPs). Proces tworzenia MIPs określany jako imprintacja molekularna polega na polimeryzacji monomerów funkcyjnych i czynnika sieciującego w obecności molekuły nazywanej wzorcem. Efektem syntezy jest polimer, który specyficznie i selektywnie wychwytuje wzorzec lub jego analogi strukturalne. MIPs są stabilne chemicznie i termicznie oraz odporne na działanie różnych czynników fizykochemicznych (np. wysokie ciśnienie, różnego rodzaju promieniowanie). Dzięki swoim właściwościom polimery ze śladem molekularnym są stosowane m.in. w metodach analitycznych (juko sorbenty w ekstrakcji do fazy stałej, sensory, wypełnienia kolumn chromatograficznych), jako systemy uwalniające leki, katalizatory w syntezie. W swoich pracach zajmuję się symulacjami układów prepolimeryzacyjnych, polimerów, procesu adsorpcji oraz teoretyczną analizą oddziaływań decydujących o rozpoznaniu molekularnym w układach MIPs. Prowadzę również prace eksperymentalne polegające na syntezie oraz badaniach właściwości MIPs.
Pomimo korzystnych właściwości tradycyjnych MIPs (otrzymywanych metodą polimeryzacji w bloku lub strąceniowej) istnieją ograniczenia w ich zastosowaniu związane z czasochłonną separacją właściwego złoża czy pozostawaniem wzorca w matrycy polimerowej po procesie obróbki. Jednym ze sposobów na pokonanie tych trudności może być otrzymanie magnetycznych molekularnie drukowanych polimerów (ang. magnetic molecularly imprinted polymers, MMIPs). Wyizolowanie ich z mieszaniny reakcyjnej nie wymaga odwirowywania i filtracji i jest łatwiejsze niż w przypadku tradycyjnych polimerów dzięki możliwości użycia zewnętrznego pola magnetycznego. Zewnętrzne pole magnetyczne upraszcza aplikację MMIPs podczas separacji związków oraz jako nośników leków do docelowego miejsca w organizmie.
Niniejszy projekt obejmuje badania wstępne dotyczące otrzymywania i analizy właściwości MMIPs. W ramach projektu mam zamiar otrzymać MMIPs przeznaczane do separacji amin biogennych. W pierwszym etapie wykonana zostanie synteza tlenku żelaza (II) diżelaza (III) (Fe3O4). Następnym krokiem będzie modyfikacja powierzchni cząstek magnetycznych (ang. magnetic nanoparticles, MNPs). W tym celu MNPs zostaną pokryte warstwą SiO2 z zastosowaniem tetraetoksysiloksanu, a następnie sfunkcjonalizowane za pomocą odpowiedniego silanu i ewentualnie surfaktantu. W kolejnym etapie wykonana zostanie synteza odpowiednich polimerów ze śladem molekularnym wybranego wzorca. Jako wzorca użyję NN-ditnetylo-2- fenyloetyloaminy, która jest analogiem strukturalnym aminy biogennej - hordeniny 4-(2-dimetyloaminoetylo)fenolu. Zamierzam otrzymać cztery polimery ze śladem molekularnym z wykorzystaniem różnych monomerów funkcyjnych: kwasu akrylowego, metakrylowego, 4-winylobenzoesowego i itakonowego. Ostatnim procesem będzie usunięcie wzorca poprzez ekstrakcję w aparacie Soxhleta. Część analityczna będzie obejmowała analizę pojemności adsorpcyjnej i powinowactwa otrzymanych polimerów do hordeniny. W analizie właściwości adsorpcyjnych wykorzystam metodę stacjonarną. Do dalszych badań wybiorę jeden polimer, wykazujący najkorzystniejsze właściwości (największe powinowactwo do analitu oraz największą pojemność adsorpcyjną). Wyznaczę parametry fizykochemiczne wybranego polimeru, takie jak: kinetyka adsorpcji, wielkość i powierzchnia ziaren, skład chemiczny, właściwości magnetyczne, wykonam analizę termograwimetryczną. Zoptymalizuję proces adsorpcji badając wpływ pH, temperatury, siły jonowej roztworu na zdolność adsorpcji analitu na imprintowanym polimerze. Zbadam selektywność polimeru w stosunku do różnych związków biogennych (tyraminy, synefryny, oktopaminy, tryptaminy, tyrozyny) oraz zdolność polimeru do adsorpcji hordeniny w próbkach modelowych i biologicznych.
Hardenina została wybrana jako docelowy analit ze względu na to, że według mojej najlepszej wiedzy, nie ma doniesień literaturowych na temat polimerów drukowanych molekularnie do selektywnej adsorpcji tej aminy biogennej. Jednocześnie hordenina wpływa na funkcjonowanie organizmu: stymuluje uwalnianie gastryny, wywołuje inhibicję monoaminooksydazy B, a także hamuje melanogenezę w ludzkich melanocytach. W związku z możliwością jej spożycia w owocach, ziołach i suplementach diety istnieje potrzeba monitorowania jej stężenia we krwi oraz w moczu. Najczęściej opisywaną w literaturze metodą oznaczania ilościowego hordeniny jest HPLC-UV, która wymaga izolowania związku i eliminowania matrycy metodą ekstrakcji do fazy stałej. Niestety dostępne handlowa sorbenty nie spełniają swojej roli w przypadku ekstrakcji hordeniny. Dlatego istnieje konieczność znalezienia selektywnego sorbentu, który pozwoli na prostą i efektywną ekstrakcję analizowanej aminy z próbek złożonych, jednocześnie niwelując wpływ matrycy biologicznej na dalsze ilościowe oznaczenia.
Spodziewanym efektem działania opisanego w projekcie będzie poszerzenie wiedzy na temat MMIPs, związków interferujących oraz procesu imprintacji molekularnej amin. Uzyskany MMIP ułatwi prowadzenie ilościowych oznaczeń hordeniny w próbkach biologicznych. Otrzymane wyniki badań wstępnych pomogą opracować optymalne warunki do otrzymania i analizy MMIPs przeznaczonych do separacji różnych analitów oraz będą pomocne podczas dalszych prac dotyczących otrzymywania postaci leków umożliwiających uwalniane substancji czynnej w określonym miejscu lub organie w organizmie.

Moje zainteresowania naukowe obejmują patogenezy miażdżycy, koncentruję się głównie na określeniu jej molekularnych mechanizmów. Głównym celem realizowanych przeze mnie badań jest opracowanie skutecznych metod profilaktycznych i terapeutycznych. Moje dotychczasowe badania koncentrowały się na ocenie wpływu czynników proaterogennych na dysfunkcji; śródbłonka naczyniowego. Obejmują one oceny roli stresu oksydacyjnego w aktywacji procesu zapalnego w komórkach śródbłonka poprzez indukcję ekspresji cząsteczek adhezyjnych (ICAM, VCAM), czynników chemotaktycznych (MCP-1) a także aktywację ścieżek sygnałowych kinaz, aktywowanych mitogenami (ERK, JNK, p38) oraz czynnika jądrowego - KB
Celem prowadzonych badań jest ocena ekspresji oraz funkcji receptorów odporności wrodzonej w rozwoju stanu zapalnego w komórkach śródbłonka. Badania będą prowadzone z wykorzystaniem:
- hodowli komórkowych - komórki śródbłonka z żył pępowinowych (HUVEC),
- preparatów blaszek miażdżycowych (N 40) materiał obecnie zebrany od pacjentów z tętnicy szyjnej podczas planowej endarektomii otwartej — badania będą wykonywane we współpracy z Kliniką Otorynolaryngologii Wydziału Lekarsko-Dentystycznego Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego (zgoda komisji bioetycznej KB/92/2008) - dysponujemy charakterystyką kliniczną tych pacjentów.
Realizacja badan obejmuje:
- określenie poziomu ekspresji receptorów: TLR 2, TLR 4, TLR 7, TLR 9, RAGE oraz białka H1MGB1 i czynnika jądrowego - KB w komórkach śródbłonka z żył pępowinowych (HUVEC) przed i po stymulacji ligandami badanych receptorów za pomocą cytometrii przepływowej
- ocenę wpływu inhibitorów poszczególnych receptorów na stymulowaną ligandami ekspresję czynnika jądrowego KB, białka HMGB1 (cytometria przepływowa) oraz ekspresję IL-6 w komórkach śródbŁonka (test Elisa)

- ocena ekspresji receptorów TLR 2, TLR 4, TLR 7, TLR 9, RAGE oraz białka H1MGB1 i czynnika jądrowego - KB w blaszce miażdżycowej za pomocą immunohistochemii

Dostępne dane naukowe wskazują na istotną rolę receptorów odporności wrodzonej, tj.: receptory toll- podobne (TLR) oraz. receptory dla zaawansowanych końcowych produktów glikacji (RAGE) w patogenezie miażdżycy. Niewłaściwa aktywacja tych receptorów powoduje zakłócenia homeostazy organizmu. Brak sygnalizacji z udziałem tych receptorów naraża organizmu na atak patogenny, natomiast nadmierna aktywacja powoduje niekontrolowane uwalnianie wielu cytokin prozapalnych oraz chemokin prowadząc do rozwinięcia stanu zapalnego, co z kolei nasila rozwój procesu miażdżycowego. Głównym wyzwaniem dla przyszłej, skutecznej terapii celowanej u pacjentów z miażdżycą jest zahamowanie procesu zapalnego związanego z tą chorobą bez wpływu na odporność wrodzoną organizmu. Toteż istotne znaczenie ma poznanie dróg transdukcji sygnału i funkcji poszczególnych receptorów odporności wrodzonej oraz. roli ich selektywnych inhibitorów. Pozwoli to na kontrolę odpowiedzi immunologicznej i blokowanie procesów negatywnych dla gospodarza. Obecnie dysponujemy jedynie wybiórczymi danymi w tym zakresie i konieczne jest przeprowadzenie badań dokumentujących wpływ hamowania aktywności tych receptorów na rozwój miażdżycy.
Planowane badania dostarczą istotnych i brakujących informacji na temat roli receptorów odporności wrodzonej w indukcji stanu zapalnego w komórkach śródbłonka. Zostanie udokumentowany wpływ selektywnych inhibitorów tych receptorów czego elektem będzie wskazanie możliwości zastosowania tych inhibitorów w leczeniu stanów zapalnych, co umożliwi kontrolę odpowiedzi immunologicznej i blokowanie procesów zapalnych bez wpływu na naturalną barierę ochronną organizmu. Ocena stopnia nasilenia stanu zapalnego poprzez określenie ekspresji wybranych receptorów w blaszce miażdżycowej pobranej od pacjentów z tętnicy szyjnej dostarczy nowych danych na temat roli tych receptorów w regulowaniu procesów zapalnych Przeprowadzone badania będą podstawą do opracowania nowych, skutecznych strategii terapeutycznych w profilaktyce oraz leczeniu miażdżycy.

Modyfikacja stylu życia za pomocą diety, regularnych ćwiczeń i kontroli wagi, jest podstawowym sposobem obniżania poziomu trójglicerydów i glukozy, a w badaniach udowodniono skuteczność takich zmian w prewencji i wspomaganiu leczenia chorób związanych z zespołem metabolicznym. Z powodu wysokich kosztów ich leczenia, zarówno w odniesieniu do życia ludzkiego jak i względów ekonomicznych, poszukiwanie bezpiecznych i skutecznych czynników naturalnych wspierających ich terapię wydaje się być wysoce pożądane. Jednym z celów terapeutycznych leczenia otyłości i innych chorób związanych z zespołem metabolicznym jest zahamowanie trawienia i wchłaniania składników odżywczych, takich jak tłuszcze i węglowodany, poprzez hamowanie działania enzymów trawiennych. Z tego powodu, kluczową rolę w tego typu schorzeniach odgrywa przewód pokarmowy i bariera jelitowa. Warstwa komórek nabłonka jelitowego stanowi złożony układ obronny oddzielający zawartość jelit od tkanek gospodarza, jak również zawiera komórki układu odpornościowego. Integralność tego układu jest niezbędna do utrzymania normalnej przepuszczalności jelitowej, gdyż jej zaburzenie prowadzi do przepływu zawartości światła jelita do krążenia (przeciek bariery jelitowej) i rozwoju stopniowo narastającego przewlekłego stanu zapalnego w tkankach. Uważa się, że wzrost przepuszczalności jest podstawą patogenezy wielu chorób, takich jak zapalenie jelita, zespół jelita drażliwego, choroby autoimmunologiczne (celiakia, zmiany atopowe), cukrzyca typu I, ostre zapalenie trzustki, marskość wątroby, jak również stwardnienie rozsiane i reumatyzm. Nawet choroby niezwiązane bezpośrednio z funkcjami śluzówki, takie jak niewydolność serca czy zawał mięśnia sercowego, są prawdopodobnie nasilane w przypadku zwiększonej przepuszczalności śluzówki. Dlatego zapobieganie przeciekom bariery jelitowej lub zapaleniu jelita przez preparaty pochodzenia roślinnego lub surowce roślinne bogate w związki bioaktywne nabiera znaczenia prewencyjnego. Niniejszy wniosek próbuje wskazać korzystną rolę leczniczych i tradycyjnych przetworów roślinnych, które są często wykorzystywane szczególnie w krajach Europy środkowej. Z powodu powszechnego stosowania w postaci herbat ziołowych, marmolad, dżemów, galaretek i napojów, wydaje się być uzasadnionym poszukiwanie wśród tych surowców związków hamujących wchłanianie niektórych składników diety. Spośród ogólnodostępnych składników dietetycznych, znaczną rolę odgrywają produkty pozyskiwane z szyszek chmielu, owoców aronii, dzikiego bzu czarnego, pigwowca, derenia czy dzikiej róży, a także kwiatów hibiskusa i orzechów laskowych. Inne, jak owoce rokitnika, berberysu, jarzębiny czy żołędzie coraz częściej zyskują na znaczeniu. Ziele bylicy draganek oraz nasiona czarnuszki służą z kolei jako przyprawy kulinarne. W kontekście poszukiwania czynników o wielokierunkowym działaniu w prewencji zespołu metabolicznego wśród gatunków roślin bogatych w związki bioaktywne, na podstawie oceny obniżania aktywności enzymów związanych z hamowaniem trawienia tłuszczów i węglowodanów zostanie przeprowadzona wstępna selekcja wybranego do badań materiału. Najbardziej aktywne wyciągi zostaną poddane kolejnym etapom sztucznego procesu trawienia. W związku z tym możliwe będzie wskazanie składników pochodzenia roślinnego, które faktycznie docierają do jelita grubego. Ostatecznie, w projekcie planowane jest przeprowadzenie badań z użyciem modelu ludzkich komórek jelita grubego – linii komórkowej Caco-2 rosnącej w monowarstwie – który jest stosowany do oceny wchłaniania związków w warunkach in vitro. Najnowsze badania donoszą o interesującej kwestii sygnałów wysyłanych przez jelitową florę bakteryjną, jak również interakcji flory bakteryjnej ze śluzówką jelita. Uważa się, że interakcja bakterie-nabłonek jest ważna dla utrzymania homeostazy jelitowej i ma ogromny wpływ na układ odpornościowy gospodarza. Projekt ma na celu wyjaśnić rolę surowców roślinnych w utrzymaniu szczelności ściany jelita i ochronie śluzówki, szczególnie przeciwko czynnikom wydzielanym przez bakterie patogenne, które mogą przenikać do krwioobiegu i wywoływać odpowiedź immunologiczną. Co więcej, badanie pozwoli na określenie, które składniki wyciągów ulegają wchłonięciu i czy mają też działanie przeciwzapalne. Wzrastająca świadomość pacjentów jest widoczna we wzroście dystrybucji probiotyków na rynku farmaceutycznym, nie tylko w związku z antybiotykoterapią. Coraz częściej probiotyki są polecane w celu zmniejszenia częstości występowania i nasilenia biegunki u dzieci, jak i chorób układu autoimmunologicznego (atopowe zapalenie skóry). Panuje pogląd, że niedojrzała warstwa kosmków jelitowych noworodków jest podstawową drogą inwazji alergenów. Produkty naturalne mogą wzmacniać funkcje fizjologicznej bariery między florą bakteryjną a jelitem, jak również chronić przed czynnikami patogennymi. Taki efekt prawdopodobnie przekłada się na korzyści zdrowotne od dzieciństwa do dorosłości. Stosowanie błonnika i związków naturalnych, szczególnie polifenoli, oraz przetworów bogatych w polifenole, używanych w życiu codziennym w postaci herbat i napojów, może stanowić skuteczne wsparcie dla konwencjonalnej terapii i prewencji chorób cywilizacyjnych. Ponadto należy zwrócić uwagę na bezpieczeństwo tych preparatów w porównaniu z lekami stosowanymi długoterminowo w terapii chorób metabolicznych. W szczególności pacjenci zniechęceni do terapii konwencjonalnej z powodu działań niepożądanych leków syntetycznych zwykle wybierają produkty naturalne. W przyszłości rozwiązanie przedstawionego zagadnienia może mieć zatem duże znaczenie prewencyjne. Mając na uwadze, że profilaktyka zapewnia więcej korzyści niż leczenie, ten rodzaj działania na poziomie jelita wydaje się korzystny zarówno dla pacjentów jak i systemu opieki zdrowotnej.