Narodowe Centrum Nauki

Celem przedstawionego projektu jest otrzymanie na drodze biosyntezy serii nowych, nieopisanych dotąd związków wielkocząsteczkowych - egzopolisacharydów pochodzenia grzybowego (β-glukanów) zawierających w swojej strukturze atomy selenu, a następnie zbadanie wpływu inkorporacji selenu do łańcucha polisacharydowego na ich cechy strukturalne oraz aktywność immunomodulacyjną. Przedstawiony projekt stanowi kontynuację badań prowadzonych w latach 2010-2011, w ramach projektu badawczego własnego MEiN N N405 613238. W wyniku przeprowadzonych w tym okresie badań zoptymalizowano warunki hodowli mycelium L. edodes na podłożach wzbogacanych w związki selenu, przeprowadzono badania specjacyjne organicznych związków selenu biosyntezowanych przez kultury mycelialne, oraz wyizolowano jedną frakcję polisacharydową zawierającą selen. Wstępne badania wpływu wyizolowanej selenowanej frakcji polisacharydowej na proliferację limfocytów krwi ludzkiej wskazały na jej silne i selektywne działanie immunosupresyjne, przy bardzo niskiej toksyczności. Wyniki badań były na tyle obiecujące, że ewentualne zastosowanie otrzymywanych na drodze biosyntezy selenowanych polisacharydów jako immunosupresantów zostało w 2012 roku objęte zgłoszeniem patentowym (P. 402082). Zarówno mechanizm inkorporacji selenu do cząsteczek egzopolisacharydów grzybowych, jak ich budowa i mechanizm wykrytego przez nas we wstępnych badaniach działania immunosupresyjnego są dotąd nieznane. W przedstawionym obecnie projekcie zaplanowano w związku z tym badania mające na celu wyjaśnienie tego interesującego problemu. Dotyczą one równocześnie niezbadanej dotąd problematyki biosyntezy, struktury oraz mechanizmu działania selenopolisacharydów.
Zamierzamy w trzech dziedzinach prowadzonych badań wykorzystać metody:
W części biotechnologicznej badań:
- Biosyntezę wzbogaconych w selen egzoplisacharydów przeprowadzimy na drodze wgłębnej hodowli mycelialnej grzyba leczniczego Lentinula edodes, należącego do klasy Basidiomycetes, wykorzystując podłoża hodowlane wzbogacane w różne związki selenu.
- Zastosujemy (opracujemy) metodę frakcjonowania tych związków umożliwiającą izolację polisacharydów o różnej masie molowej, składzie monosacharydowym i zawartości selenu poprzez użycie do ekstrakcji eluentów o różnej polarności i charakterze chemicznym.
W części analitycznej badań:
- Zastosujemy do badań nieznanego dotąd sposobu w jaki selen jest związany ze strukturą polisacharydów metodę rentgenowskiej spektroskopii absorpcyjnej (XANES, XAFS) oraz magnetycznego rezonansu jądrowego (widma selenowe NMR)
- Przeprowadzimy dokładną analizę budowy selenopolisacharydów, poprzez wykorzystanie metod:
• do oznaczania składu monosacharydowego, po całkowitej hydrolizie, metodę wysokosprawnej chromatografii cieczowej,
• do oznaczania masy molowej izolowanych polisacharydów wykorzystamy technikę chromatografii żelowej (GPLC),
• do oznaczania struktury pierwszorzędowej, wykorzystamy metody degradacyjne, z wykorzystaniem hydrolizy enzymatycznej oraz zmodyfikowanej metody Hakomori - poprzez wstępną metylację, a następnie hydrolizę analizowanych frakcji,
• do oznaczania typu wiązań glikozydowych zastosujemy metody spektralne IR i NMR,
• do oznaczania struktury przestrzennej zastosujemy metody (2D) NMR
W części immunologicznej badań:
- Zbadamy wpływ Se-polisacharydów o zróżnicowanej masie molowej, zawartości selenu i strukturze i na proliferację limfocytów T i B krwi ludzkiej, poprzez przeprowadzenie testów OKT3, PHA i SAC
- Zbadamy czy Se-polisacharydy wykazują zdolność aktywacji makrofagów, komórek NK, oraz czy wpływają na odpowiedź zależną od limfocytów T.
Zakładamy, że wyniki zaplanowanych badań pozwolą wysunąć hipotezę dotyczącą przyczyn nietypowej dla polisacharydów pochodzenia grzybowego, stwierdzonej we wstępnych badaniach aktywności immunosupresyjnej selenowanych frakcji polisacharydowych. Zakładamy również , że uda nam się zbadać, w jakim stopniu inkorporacja selenu do cząsteczki egzopolisacharydów zmienia ich strukturę przestrzenną, co z kolei zapewne wpływa na wiązalność tych związków z receptorami CR-1 i CR-3. Wyniki badań powinny również rozszerzyć zakres wiedzy na temat metabolizmu związków selenu przez grzyby oraz możliwości biosyntezy przez nie selenopolisacharydów. Efektem badań powinny być publikacje w czasopismach z listy JCR oraz doniesienia zjazdowe. Zakładamy, że badania przyczynią się do rozwoju młodej kadry naukowej, stanowiąc przedmiot pracy/prac doktorskich. Jest również prawdopodobne zastosowanie ich wyników do zaprojektowania i otrzymywania innowacyjnego leku o działaniu immunosupresyjnym, należącego do nowej grupy chemicznej.

Celem planowanych badań jest wykrywanie obecności 13 zidentyfikowanych w genomie S. mutans UA159 (ATCC 700610) dwuskładnikowych systemów regulacyjnych (TCS) oraz zbadanie roli czterech z nich, poprzez konstrukcje delecyjnych mutantów klinicznych izolatów S. mutans, w tworzeniu płytki nazębnej u dzieci oraz dorosłych uwzględniając dwa typy zębów (stałe i mleczne). Otrzymane szczepy ze zinaktywowanymi genami kodującymi domeny sensorowe analizowane będą pod kątem wytwarzanej biomasy oraz struktury tworzonego biofilmu. W ramach niniejszego projektu planowana jest również ocena lekowrażliwości szczepów klinicznych S. mutans oraz otrzymanych mutantów na wybrane antybiotyki i chemioterapeutyki. Pobrane zostaną wymazy z powierzchni zębów dzieci oraz dorosłych i posiane na podłoże Mitis Salivarius Agar uzupełnione sacharozą, bacytracyną i tellurynem potasu, po czym inkubowane przez 48 h w temperaturze 37°C w 5% stężeniu C02. Identyfikacja obejmować będzie dwa etapy: identyfikację na podstawie cech biochemicznych oraz identyfikację genetyczną z zastosowaniem metody nested-PCR. W dalszej części projekt będzie bazował na podstawowych technikach biologii molekularnej (tj. izolacja materiału genetycznego, PCR, Multiplex PCR. analiza restrykcyjna itp.). Do identyfikacji 13 TCS posłuży metoda Multiplex PCR i/lub klasyczny PCR. Do inaktywacji genów kodujących systemy dwuskładnikowe z kolei wykorzystana zostanie metoda mutagenezy ligacyjnej. Zdolność i intensywność tworzenia biofilmu in vitro na polistyrenowych płytkach titracyjnych zarówno przez izolaty kliniczne jak i szczepy zmutowane oceniana będzie metodą barwienia fioletem krystalicznym oraz metodą barwienia MTT z wykorzystaniem spektrofotometru. Hodowla biofilmu zakładana będzie na podłożu BHI i inkubowana w temperaturze 37°C w 5% stężeniu CO., przez 24h do 48h. Z kolei struktura biofilmu badana będzie za pomocą elektronowej mikroskopii skaningowej. Ocena lekowrażliwości szczepów klinicznych S. mutans i mutantów przeprowadzona zostanie z wykorzystaniem systemu Vitek-2 Compact. S. mutans jest jednym z najważniejszych gatunków drobnoustrojów spośród mikroflory zasiedlającej jamę ustną osób dorosłych i dzieci bezpośrednio związany z powstawaniem próchnicy zębów stałych oraz mlecznych. Próchnica stanowi bardzo poważne i powszechnie występujące schorzenie o podłożu zakaźnym i mimo postępów w dziedzinach stomatologii oraz higieny, pozostaje wciąż istotnym problemem naszego społeczeństwa. Jednym z ważnych czynników wirulencji bakterii prochnicotwórczych w tym S. mutans jest zdolność do tworzenia płytki nazębnej tzw. naturalnego biofilmu. W zróżnicowanym środowisku jakim jest jama ustna bakterie żyjące w strukturze biofilmu narażone są na różnego rodzaju niekorzystne czynniki środowiskowe tj.: zmiany temperatury, warunków żywieniowych oraz natężenie tlenu. Ich zdolność do adaptacji, przetrwania oraz wywołania tak poważnej jednostki chorobowej jaką jest próchnica wskazuje na konieczność dogłębnej analizy molekularnych mechanizmów odpowiedzi bakterii żyjących w biofilmie na napotkane warunki stresowe. Jak wykazano w przypadku S. mutans odpowiedź na zmiany zachodzące w środowisku odbywa się z udziałem dwuskładnikowych systemów regulacyjnych. Dlatego dogłębne poznanie budowy i funkcjonowania TCS wydaję się niezbędne do całkowitej eliminacji bądź modyfikacji cech tego drobnoustroju tym bardziej, że badania ostatnich lat wykazały, że dwuskładnikowe systemy regulacyjne mogą stanowić nowe potencjalne miejsca działania leków.