Narodowe Centrum Nauki

Celem projektu jest poszukiwanie wariantów genetycznych predysponujących do wczesnego zgonu w grupie dorosłych osób reprezentatywnych dla populacji polskiej. Projekt ma odpowiedzieć na pytania:
1) Jakie znane warianty genetyczne predysponujące do wczesnej śmierci występują szczególnie często w populacji polskiej. Jaki są względne częstości poszczególnych wariantów i czy występują warianty, których znaczenie jest obecnie niedoszacowane.
2) Jakie nowe warianty genetyczne (nieznane mutacje w genach o poznanej funkcji oraz mutacje w genach dotychczas nie wiązanych z chorobami) występują w populacji polskiej, przyczyniając się do wczesnej śmierci osób dorosłych.
Oczekuje się, że wyniki projektu wskażą najczęstsze choroby genetyczne przyczyniające się do wczesnego zgonu wśród dorosłych w Polsce. Z dużym prawdopodobieństwem można oczekiwać znalezienia min. 10-20 przypadków występowania mutacji o czytelnym efekcie i wyraźnym związku z przyczyną zgonu, (opisane wcześniej mutacje, nowe niszczące mutacje w znanych genach). Dodatkowo istnieje możliwość wyłonienia nowych genów, których defekty mogą wywoływać poważne, bo prowadzące do wczesnego zgonu, choroby u człowieka.
Ze względu na reprezentatywność kohorty WOBASZ dla populacji całej Polski wyniki pozwolą na oszacowanie roli znanych chorób rzadkich w umieralności dorosłych w skali naszego kraju. Wyniki projektu mogą wskazać na celowość szerszego niż obecnie wykonywania badań genetycznych w kierunku pewnych mutacji wśród osób z określonymi chorobami lub nawet na zasadność badań przesiewowych całej populacji. Wyłonienie nowych genów powiązanych z umieralnością ma znaczenie dla badań podstawowych z zakresu biologii, fizjologii i medycyny.
Projekt jest pierwszą próbą zastosowania WES w badaniu epidemiologicznym w Polsce. WES był szeroko stosowany w badaniach epidemiologicznych w innych krajach jednak brak jest doniesień nt. wykorzystania tej technologii w analizie wczesnej umieralności porównywalnego z opisanym we wniosku.

Rak jajnika ma najwyższy wskaźnik śmiertelności wśród wszystkich nowotworów kobiecych narządów rodnych, z 5-letnim okresem przeżycia pacjentek wynoszącym tylko 30%. Powodem tak niskiej przeżywalności chorych jest późne rozpoznanie, spowodowane brakiem objawów klinicznych oraz brakiem odpowiednich biomarkerów umożliwiających wykrycie choroby w jej wczesnym stadium. Ważnym jest fakt, że chociaż niektóre z podtypów raka jajnika początkowo odpowiadają dobrze na zabiegi terapeutyczne, pojawiająca się w późniejszym czasie oporność stanowi wciąż znaczący problem kliniczny. Konieczne są więc dalsze badania mające na celu pogłębienie rozumienia molekularnych zjawisk zachodzących w komórkach raka jajnika, zwłaszcza w kontekście poszukiwania nowych strategii leczniczych. Podobnie jak w przypadku innych nowotworów, rak jajnika wykorzystuje cały szereg mechanizmów prowadzących do zahamowania aktywności układu odpornościowego. Celem projektu jest kompleksowa ocena roli dwóch związanych z egzosomami enzymów (arginazy 1 i 2), biorących udział w rozkładzie aminokwasów endogennych, w osiągnieciu przez rak jajnika zdolności do ucieczki spod nadzoru immunologicznego. Rozwój przewlekłego zapalenia i indukcja szlaków enzymatycznych rozpadu argininy uznawane są jako istotne czynniki zaangażowane w tym mechanizmie. Tak więc wysuwamy hipotezę, że poprzez uwolnienie zawierających arginazę egzosomów, które następnie rozprzestrzeniają się systemowo poprzez układ krążenia, komórki nowotworowe prowadzą do globalnego niedoboru L-argininy a przez to do ogólnoustrojowego upośledzenia limfocytów T, niezbędnych do rozwoju efektywnej odpowiedzi przeciwnowotworowej. Mając też na uwadze niedawne opracowanie inhibitorów szlaków metabolicznych aminokwasów, zakładamy również, że zahamowanie aktywności enzymatycznej wyżej wymienionego układu enzymatycznego stanowić może cel dla nowatorskich strategii przeciwnowotworowych, zwłaszcza w połączeniu z już istniejącymi terapiami celowanymi na poziomie molekularnym, ale także klasyczną chemioterapią.

Projekt ma na celu zbadanie mechanizmu rozwoju endometriozy - częstej choroby kobiet powodującej dolegliwości bólowe, niepłodność a niekiedy prowadzącej do rozwoju raka jajnika, W przebiegu choroby, endometrioidalna tkanka nabłonkowa rozwija się ektopowo, najczęściej w obszarze jamy otrzewnowej. Najszerzej uznana teoria rozwoju choroby postuluje, że ogniska ektopowej tkanki endometrioidalnej wywodzą się z endometrium eutopowego, lecz wiele aspektów' choroby pozostaje niewytłumaczonych. Jedną z niepotwierdzonych dotąd hipotez jest akumulacja mutacji somatycznych w komórkach nabłonka endometrium eutopowego. Udowodniono, że w przebiegu raka endometrialnego jajnika dochodzi do mikrodelecji w komórek ognisk endometriozy, z których następnie wywodzi się nowotwór, natomiast w zmianach endometrioidalnych nietow'arzyszących rakowi nie stwierdzono takich mikrodelecji. W proponowanym projekcie planuje się zbadać sekwencje eksomowc tkanek pochodzących od kobiet chorych na endometriozę oraz zdrowych kobiet. Na podstawie analizy uzyskanego wzoru mutacji planujemy ustalić czy istnieją mutacje somatyczne w ektopowym endometrium, mogące być przyczyną powstawania zmian ektopowych.

Wiadomo, że prawidłowe funkcjonowanie ludzkiego organizmu zależy w dużym stopniu od bakterii, które znajdują się w jelitach. Najnowsze badania wskazują, zaburzenia w składzie flory jelitowej są związane z nadciśnieniem tętniczym. Bytujące w jelitach bakterie wytwarzaj szereg związków chemicznych, które przedostają się do krwi, między innymi siarkowodór (H2S) oraz metan. Celem proponowanego projektu jest zbadanie wpływu zwiększonego stężenia H2S i metanu w jelitach na regulację ciśnienia tętniczego oraz rozwoju nadciśnienia tętniczego. W trakcie badania zostaną wytworzone także nowe związki, które mogą uwalniać H2S. Badania zostaną przeprowadzone na szczurach. Nadciśnienie tętnicze i jego powikłania są jednymi z głównych przyczyn zachorowalności i śmiertelności w Polce i UE. Wyniki proponowanego badania pomogą wyjaśnić rolę metabolitów wytwarzanych przez bakterie jelitowe w regulacji ciśnienia tętniczego oraz w patogenezie nadciśnienia tętniczego. Badanie pomoże ocenić czy leki zmieniające stężenie H2S i metanu w jelitach mogą być stosowane w leczeniu chorób układu krążenia, w szczególności nadciśnienia tętniczego.

Badanie ma na celu poznanie wpływu bakterii jelitowych oraz produkowanych przez nie metyloamin na rozwój nadciśnienia tętniczego. Najnowsze badania wskazują, że nadciśnienie tętnicze może być związane z zaburzeniami w składzie flory jelitowej. Wpływ bakterii jelitowych na funkcjonowanie układu krążenia może odbywać się poprzez szereg związków chemicznych wytwarzanych przez mikroflorę jelitową, które przedostają się do krwi. Co raz więcej badań sugeruje, że ważną rolę w patogenezie chorób układu krążenia mogą odgrywać wytwarzane przez bakterie jelitowe metyloaminy. Wykazano, że wzrost stężenia tlenku trimetyloaminy we krwi jest związany z większym ryzykiem wystąpienia zawału mięśnia sercowego, udaru mózgu oraz śmierci.
W proponowanym projekcie będą prowadzone badania na szczurach pojonych wodą lub wodą zawierająca badane metyloaminy. Badany będzie wpływ metyloamin na wartości ciśnienia tętniczego oraz pracę serca. Nadciśnienie tętnicze oraz jego powikłania są jednymi z ważniejszych przyczyn zgonów i inwalidztwa. Proponowany projekt ma na celu zbadanie nowych związków, które mogą być odpowiedzialne za rozwój nadciśnienia tętniczego. Wyniki badania mogą przyczynić się do stworzenia nowej grupy leków na nadciśnienie tętnicze, których mechanizm działania będzie opierał się na modyfikacji produkcji metyloamin w jelitach człowieka.

Ostra białaczka limfoblastyczna B-komórkowa (B-OBL) jest zróżnicowaną biologicznie grupą chorób u podłoża, której leżą specyficzne zmiany genetyczne powodujące zaburzenia różnicowania i proliferacji komórki krwiotwórczej. W ostatnich latach obserwuje się duży postęp w leczeniu B-OBL, szczególne u dzieci. Niestety wyniki leczenia u dorosłych pozostają ciągle niesatysfakcjonujące. Jedną z przyczyn tego stanu rzeczy może być występowanie u ponad połowy dorosłych z B-OBL dwóch genetycznych podtypów białaczki o bardzo wysokim ryzyku progresji choroby – BCR-ABL1-pozytywnej i BCR-ABL1-like. Obydwa podtypy białaczek mimo występowania u ich podłoża różnych zmian genetycznych wykazują podobny profil ekspresji genów, który w konsekwencji prowadzi do aktywacji szlaku JAK-STAT. Ostatnie doniesienia wskazują, że zarówno B-OBL BCR-ABL1-pozytywna, jak i BCR-ABL1-like może łączyć podobny mechanizm odpowiedzialny za progresję choroby, co ma związek z niekorzystnym rokowaniem. Wykazano, że zarówno białaczka BCR-ABL1-pozytywna jak i BCR-ABL1-like charakteryzują się wysokim odsetkiem występowania specyficznych mutacji genetycznych (zmian w liczbie kopii fragmentów DNA; CNAs), głównie delecji. Ich obecność wynika prawdopodobnie z nieprawidłowej aktywności niektórych enzymów komórkowych. Kompleks rekombinaz – RAGs oraz białek z rodziny APOBEC, w tym deaminaza cytydyny AID są enzymami zaangażowanymi w bardzo ważny proces fizjologiczny, a mianowicie wytworzenie funkcjonalnych przeciwciał oraz powstanie ich różnorodność w kontakcie z patogenem. Aktywność obu enzymów jest charakterystyczna dla tkanek limfoidalnych z których wywodzi się właśnie B-OBL. Jest to jednak obosieczny miecz, który z jednej strony pozwala organizmowi na wytworzenie przeciwciał, które chronią nas przed zagrożeniem ze strony drobnoustrojów, z drugiej natomiast moge być przyczyną zmian genetycznych prowadzącym do powstawania i progresji nowotworów. Dlatego w projekcie uwaga zostanie skupiona właśnie na endogennych mutatorach genomowych jakimi są RAGs, AID, APOBEC3A, APOBEC3B. W tym celu zostaną zastosowane różne metody biologii molekularnej w tym sekwencjonowania DNA oraz analiza ekspresji genów.
Projekt ma na celu wyjaśnienie podłoża molekularnego prowadzącego do złej prognozy u dorosłych z B-OBL, a konkretnie zjawiska niestabilności genetycznej mediowanej przez RAGs oraz białka z rodziny APOBEC. Podczas niestabilności genetycznej dochodzi do akumulacji mutacji, co sprzyja selekcji klonów białaczkowych i powoduje progresję choroby. Pomimo dużego postępu w tej dziedzinie nauki wciąż za mało jest wiedzy na ten temat. Powyższe badania mogą również mieć przełożenie na inne dziedziny onkologii, stanowiąc punkt wyjścia i inspirację do powtórzenia podobnych badań w innych jednostkach chorobowych.

Celem projektu jest zbadanie działań biologicznych tlenku trimetyloaminy (TMAO), który jest wytwarzany przez bakterie jelitowe i może mieć wpływ na prawidłową funkcję serca oraz całego układu krążenia. Niewydolność serca jest jedną z najważniejszych kardiologicznych przyczyn śmierci, licznych hospitalizacji, inwalidztwa oraz obniżenia jakości życia. Najnowsze badania wskazują, że ważną rolę w chorobach układu krążenia może odgrywać TMAO, metabolit bakterii jelitowych. W ostatnich latach pojawiły się doniesienia, że wzrost stężenia tlenku trimetyloaminy (TMAO) we krwi jest związany z większym ryzykiem wystąpienia zawału mięśnia sercowego, udaru mózgu oraz śmierci. Wzrost stężenia TMAO może być spowodowany dietą, upośledzeniem funkcji jelit, lub zmianami w składzie jelitowej flory bakteryjnej. Wiadomo, że stężenie TMAO we krwi wzrasta po spożyciu pokarmów zawierających L-karnitynę oraz fosfatydocholinę, które występują w dużej ilości między innymi w czerwonym mięsie. Zaproponowano, że TMAO może stanowić długo poszukiwane ogniwo miedzy dietą, a chorobami układu krążenia. Z drugiej strony, duża liczba wcześniej prowadzonych badań nad rolą TMAO w biologii zwierząt morskich oraz badania fizykochemiczne nad wpływem TMAO na białka wskazują na ochronne działanie TMAO. Dlatego można przypuszczać, że wzrost stężenia TMAO we krwi nie jest przyczyną, a działaniem obronnym organizmu, stanowiącym mechanizm ochronny przed czynnikami zaburzającymi prawidłowe funkcjonowanie układu krążenia. Kolejnym z argumentów wskazujących na korzystne działanie TMAO może być fakt, że TMAO występuje w bardzo dużych stężeniach u ryb, szczególnie ryb morskich, które są ważnym elementem wielu diet uważanych za korzystne dla układu krążenia, na przykład w diecie śródziemnomorskiej.

Choroby nowotworowe stanowią ważny, wciąż nierozwiązany problem medycyny klinicznej i farmakologii XXI wieku. Dlatego też prowadzone są intensywne badania nad opracowaniem nowych leków przeciwnowotworowych, specyficznie niszczących komórki nowotworowe, a nie wywołujących negatywnych skutków ubocznych i o polepszonych parametrach farmakokinetycznych. W Laboratorium Przesiewowym Związków Przeciwnowotworowych działającym w Zakładzie Chemii Bioorganicznej Centrum Badań Molekularnych i Makromolekularnych PAN w Łodzi odkryto interesujące właściwości cytotoksyczne kilku związków z grupy benzo[b]furanów i dikarboksyimidów zaprojektowanych i wytworzonych w Zakładzie Chemii Medycznej Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego. Związki te okazały się cytotoksyczne w stosunku do komórek białaczek CML (K562), ALL (MOLT-4) i AML (HL-60), natomiast są nietoksyczne dla prawidłowych komórek śródbłonka (HUVEC) oraz nowotworowych komórek adherentnych (HeLa i CFPAC). Związki te i ich aktywność przeciwnowotworowa zostały ochronione patentami polskimi i międzynarodowymi (EP13150611.5-1452, EP13176421.9, P.398193, P.400000)
Cel badań: Przeprowadzenie zaawansowanych badań przedklinicznych dla wybranych pochodnych benzo[b]furanów i dikarboksyimidów jako potencjalnych związków przeciwbiałaczkowych, w tym zbadanie ich aktywności wobec hematopoetycznych komórek macierzystych pobranych od pacjentów z AML i CML i in vivo, w modelach zwierzęcych oraz poznanie molekularnego mechanizmu działania tych związków w komórkach.

Cel prowadzonych badań/hipoteza badawcza: Nowotwory tarczycy stanowią najczęstszą grupę nowotworów endokrynnych, a ich liczba stale wzrasta. Najczęstszym, stanowiącym 85% ogółu, jest rak brodawkowaty tarczycy (PTC). Podstawą jego leczenia jest chirurgiczna resekcja tarczycy wraz z regionalnymi węzłami chłonnymi oraz terapia uzupełniająca polegająca na podaniu promieniotwórczego jodu 1131. Część pacjentów jest jednak oporna na terapię jodem radioaktywnym. Wobec ograniczonej skuteczności innych form leczenia, m. in. teleradioterapii, chemioterapii, chorzy ci umierają z powodu agresywnego przebiegu choroby. Stąd też konieczne jest poszukiwanie nowych terapii.
Produkt białkowy genu SLC5A8 został pierwotnie zidentyfikowany jako transporter jodkowy obecny w błonie szczytowej tyreocytów i z tego powodu nazwany AIT (ang. Apical Iodide Transporter) Jest też supresorem nowotworzenia, a jego ekspresja jest obniżona w wielu nowotworach, w tym w PTC Najwięcej badań dotyczących jego funkcji supresorowej dotyczy jelita grubego i opiera się na zdolności AIT do transportu krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych Tylko kilka prac wspomina o modulacji przez SLC5A8 innych genów zaangażowanych w proces nowotworzenia, a są to geny tak fundamentalne jak TP53, FASL, FASR, Bcl-2, TRAIL, TRAILR1 i 2, BIRC5 Zaskakujące jest zatem, że nikt nie przeprowadził zmian wywoływanych przez nadekspresję SLCSA8 na poziomie całego transkryptomu. Istnieją jedynie nieliczne badania nad regulacją ekspresji SLC5A8, co skierowało naszą uwagę na rolę mikroRNA w tym procesie MikroRNA (miRNA) to około 22 nukleotydowe niekodujące cząsteczki RNA, które hamują ekspresję genów poprzez wiązanie z komplementarną sekwencją w ich transkryptach, W wykonanych przez nas badaniach wstępnych wykazaliśmy, że miR-181a-5p, -182-5p i -494 regulują ekspresję SLC5A8, a ich podwyższony poziom w PTC może prowadzić do obniżenia ekspresji SLCSA8. Wykazaliśmy także wpływ mikroRNA na proces transportu jodu radioaktywnego. Zmiany w ekspresji mikroRNA można modulować poprzez specyficzne inhibitory, dlatego też potwierdziliśmy, że transfekcja syntetycznym inhibitorem miR-181a-5p zwiększa ekspresję mRNA SLC5A8 i postawiliśmy hipotezę, że hamując aktywność zidentyfikowanych mikroRNA spowodujemy zwiększenie ekspresji SLC5A8. co doprowadzi do zwiększonej akumulacji jodu radioaktywnego oraz do zmiany poziomu genów regulowanych przez SLC5A8, co może zwiększyć skuteczność terapii przeciwnowotworowych.
Celem projektu jest wykorzystanie specyficznych inhibitorów mikroRNA do przywrócenia właściwego poziomu SLC5A8 w komórkach wyprowadzonych z raka tarczycy. Przeprowadzimy podwójną analizę wpływu podwyższonej ekspresji SLC5A8 na fizjologię komórek: za pomocą sekwencjonowania nowej generacji określimy całkowity transkryptom linii komórkowych, w których zahamowane zostanie działanie wybranych mikroRNA (analiza potencjalnej cytotoksyczności inhibitorów). Następnie zbadamy całkowity transkryptom linii komórkowych, w których przeprowadzimy nadekspresję genu SLCSA8 (analiza roli SLC5A8 w regulacji ekspresji genów). Dzięki tej analizie zidentyfikujemy szlaki, w których SLC5A8 wywiera swoją rolę supresorową. MiR-181a-5p, -182-5p i -494-3p ulegają nadekspresji także w innych nowotworach, możemy zatem nazywać je onkomiRami. Tym bardziej uzasadnione jest zbadanie wpływu ich inhibicji na zmiany zachodzące na poziomie całego transkryptomu. Następnym krokiem będzie porównanie zmian w ekspresji genów wywołanych nadekspresją SLC5A8 oraz inhibicją mikroRNA. Nie tylko dostarczy to listy genów docelowych, ale także przybliży nas do odpowiedzi na pytanie, czy tkankowospecyficzna inhibicja tych mikroRNA mogłaby w przyszłości znaleźć zastosowanie terapeutyczne. Zastosowana metoda badawcza/metodyka: Podczas realizacji projektu stworzymy plazmid wyrażający sekwencję kodującą genu SLC5A8 oraz tzw. sponge dla miR-181a-5p, -182-5p i -494, wyrażający transkrypt o sekwencji komplementarnej do 3 mikroRNA, działający jako specyficzny inhibitor tych cząsteczek.. Optymalne warunki transfekcji określimy mierząc ekspresję SLC5A8 oraz co najmniej jednego z jego opisanych genów docelowych za pomocą PCR czasu rzeczywistego. Po określeniu optymalnego protokołu z komórek wyizolujemy RNA, przygotujemy bibliotekę cDNA i poddamy sekwencjonowaniu nowej generacji (NGS). Stworzymy listy genów o ekspresji zmienionej pod wpływem nadekspresji SLC5A8 oraz (osobno) wyciszenia mikroRNA. Następnie porównamy ze sobą te listy, celem określenia zmian wywołanych nadekspresją genu, zmian wywołanych przez wyciszenie wybranych mikroRNA, a w konsekwencji określimy potencjalną użyteczności inhibitorów mikroRNA w przywracaniu ekspresji SLC5A8 w raku PTC. Wpływ spodziewanych rezultatów na rozwój nauki, cywilizacji, społeczeństwa: Będzie to pierwszy projekt w ramach którego zostanie scharakteryzowany wpływ SLC5A8 na ekspresję innych genów na poziomie całego transkryptomu. Określimy także możliwości przywrócenia jego ekspresji za pomocą inhibicji mikroRNA. Co istotne, dzięki zastosowaniu techniki NGS wskażemy użyteczne z terapeutycznego punktu widzenia inne geny docelowe dla tych mikroRNA. Porównamy zmiany wywołane nadekspresją genu SLC5A8 z wywołanymi przez wyciszenie wybranych przez nas mikroRNA, które regulują także inne geny docelowe, w tym zaangażowane w supresję nowotworzenia. Dzięki temu określimy potencjalną użyteczność wyciszania wybranych mikroRNA u pacjentów cierpiących na raka brodawkowatego tarczycy.

Komórki nabłonkowe jelita stanowią pojedynczą warstwę nabłonka, która formuje barierę oddzielającą zawartość światła jelita od komórek immunokompetentnych układu GALT Nabłonek jelitowy jest obecnie uważany za ważną część układu immunologicznego jelita niezbędną w indukcji i regulacji zarówno nieswoistych, jak i swoistych odpowiedzi immunologicznych w błonie śluzowej jelita. Zaburzenia funkcji immunologicznych komórek nabłonkowych mogą przyczyniać się do rozwoju nieswoistych zapaleń jelita (NZJ) oraz alergii pokarmowych. Głównym celem projektu jest ocena oddziaływań bakteriofagów (wirusów bakteryjnych) na funkcje immunologiczne nabłonka jelitowego in vitro.
Zastosowana metoda badawcza/metodyka
Wszystkie doświadczenia będą przeprowadzone na linii komórkowej Caco-2. W pierwszym etapie badania oceniony będzie wpływ bakteriofagów na ekspresję wybranych genów ważnych dla funkcji immunologicznych nabłonka jelitowego. Ekspresja genów oceniana będzie przy użyciu zestawu RT2 Profiler PCR Assay. Istotne indukowane przez bakteriofagi zmiany w ekspresji genów będą weryfikowane przez zmierzenie produkcji odpowiednich białek metodą ELISA (dla białek rozpuszczalnych) lub cytometrią przepływową (dla białek błonowych).
Wpływ spodziewanych rezultatów na rozwój nauki, cywilizacji, społeczeństwa
Zgodnie z nasza wiedzą, jest to pierwsze badanie oceniające wpływ bakteriofagów na funkcje immunologiczne nabłonka jelitowego. Realizacja projektu poszerzy wiedzę o roli mikroflory jelitowej w regulacji homeostazy immunologicznej w błonie śluzowej jelita oraz patogenezy NZJ i alergii pokarmowych.