Narodowe Centrum Nauki

Pasożyty z rodzaju Trypanosoma (Świdrowce) cechują się unikalną fizjologią komórkową, ponieważ przeprowadzają istotne procesy glikolityczne i peroxysomalne w jednym organellum, glikosomie. Ponieważ glikosomy nie zawierają informacji genetycznej, wszystkie enzymy aktywne w tym kompartmencie muszą być tam dostarczane posttranslacyjnie. Grupa enzymów zwanych peroksynami (małe białka peroksysomalne, PEX#) zawiadują tym transportem. Spośród nich, PEX5 oraz PEX14 pełnią ważną rolę w tym szlaku biochemicznym, ponieważ wytworzenie kompleksu między nimi jest niezbędne do zaimportowania białek z macierzy komórkowej do glikosomu. Z tego względu postuluje się iż niedopuszczenie do wytworzenia tego kompleksu, np. za pomocą małocząsteczkowej substancji lekopodobnej mogło by być interesującą strategią walki z chorobami powodowanymi przez Świdrowce, jak również metodą poznawania procesów biochemicznych zachodzących w glikosomach. Interakcje międzybiałkowe należą do celów molekularnych szczególnie trudnych. Tak jak w przypadku wielu innych interakcji międzybiałkowych, oddziaływanie PEX14 z PEX5 jest głównie natury hydrofobowej i aromatycznej, z zaledwie dwoma płytkimi, eksponowanymi kieszeniami wiążącymi zlokalizowanymi na dużej powierzchni kontaktu. W rezultacie, aby być zdolną do konkurowania o miejsca wiążące na powierzchni PEX14, ‘konwencjonalna’, ‘lekopodobna’ cząsteczka chemiczna musiała by mieć ściśle lipofilowy charakter. To z kolei implikuje trudności z zachowaniem parametrów farmakochemicznych w pożądanych zakresach. Z tego względu istnieje konieczność poszukiwania strategii alternatywnych inhibicji tego trudnego celu molekularnego, innych niż ‘klasyczne’ małocząsteczkowe związki chemiczne. Celem tego projektu jest próba wykorzystania mimetyków alfa helisy, pochodnych oksopiperazyny, jako nowych inhibitorów interakcji białek PEX14 i PEX5 o wysokiej skuteczności przeciwpasożytniczej i odpowiednich właściwościach farmakochemicznych. Multidyscyplinarne podejście do tego realizacji tego celu będzie opierać się na takich metodach badawczych jak synteza chemiczna, komputerowe projektowanie ligandów w oparciu o strukturę białka, jak również na oznaczeniach biofizycznych i komórkowych. Wnioski wyciągnięte z tych badań mogą być ważne nie tylko dla projektowania przyszłych potencjalnych leków przeciw chorobom tropikalnym, lecz także powinny przysłużyć się lepszemu zrozumieniu procesów biochemicznych zachodzących w glikosomach.

Projekt zakłada otrzymanie serii nowych związków chemicznych, pochodnych hydroksykumaryn, o wysokim powinowactwie do receptorów serotoninergicznych i transportera serotoniny. Związki zaprojektowano w oparciu o przegląd literaturowy i przy użyciu metod modelowania molekularnego. Struktury związków zostały zaplanowane w oparciu o dotychczasowe badania w których otrzymano pilotażowe serie arylopiperazynylopropoksylowych i butoksylowych pochodnych 8- acetylo-7-hydrosky-4-metylokumaryny, określono ich profil działania i powinowactwo do niektórych receptorów serotoninergicznych. Wstępne wyniki są optymistyczne i zachęcają do dalszych badań. Ustalono, że wprowadzenie grupy acetylowej w pozycję 8 pierścienia kumaryny przyczyniło się do znacznego wzrostu powinowactwa do receptora 5-HT1A ( Ki= 89,2 nM dla związku bez grupy acetylowej do Ki=0,8 nM dla 8- acetylo-7-{4-[4-(3-metoksyfenylo)-1 -piperazynylo]butoksy}-4-metylokumaryny). Ponadto, dzięki dokowaniu molekularnemu ustalono, że związki tego typu są stabilizowane w kieszeni receptora głownie przez wiązanie wodorowe między Ser190 i grupą acetylową kumaryny. Wiązanie to było już wcześniej opisywane jako ważne w wiązaniu ligandów (innych niż kumarynowe) do receptora 5-HT1A. Znaczenie ma także podstawienie pozycji 4 w pierścieniu kumaryny grupą metylową oraz oczywiście dobór odpowiedniego łącznika i pochodnych arylopiperazyny zawierających podstawniki w pozycji orto lub orto/meta pierścienia fenylowego. Opierając się na powyższych danych zdecydowałam się na syntezę nowych arylopiperazynylowych pochodnych hydroksykumaryn z zastosowaniem trój/cztero/piecio i sześciowęglowego linkera oraz szeregu amin. Syntezy organiczna bazuje na pewnych i sprawdzonych reakcjach chemicznych. Związki, zaplanowane, w ramach projektu, będą otrzymane w wyniku kilkuetapowych syntez organicznych, w większości z zastosowaniem reaktora mikrofalowego. Pochodne będą oczyszczane metodami krystalizacji bądź chromatografii kolumnowej, a ich struktury potwierdzone za pomocą widm 'H NMR, l3C NMR, MS, oraz metodami krystalograficznymi dla wybranych cząsteczek.
Podstawowym rezultatem przedstawionego projektu będzie otrzymanie oczyszczenie i potwierdzenie struktur zaplanowanych związków chemicznych o spodziewanej aktywności farmakologicznej. Rezultaty zostaną opublikowane w międzynarodowych czasopismach. Przewidujemy otrzymanie arylopiperazynylowych pochodnych 8-acetylo-7-hydrosky-4-metylokumaryny i 6-acetyIo-5-hydroksy-4,7-dimetylokumaryny, zawierających grupę acetylową w pozycji orto względem grupy hydroksylowej w kumarynie. Arylopiperazynylowe pochodne 5-hydroksykumaryny nigdy dotąd nie były opisane w literaturze naukowej, ani badane pod kątem powinowactwa do receptorów serotoninowych. Projekt pozwoli wzbogacić bibliotekę pochodnych kumaryn o nowe pochodne a uzyskane wyniki będą składały się na materiał rozprawy habilitacyjnej kierownika projektu. Ponieważ projekt wpisuje się w ramy chemii medycznej, konieczne będą badani a farmakologiczne (poza przedstawionym wnioskiem). Powinowactwo do receptorów serotoninergicznych i transportera serotoniny zostaną okrślone w oparciu o badania in vitro (w ramach współpracy naukowej z Katedrą Farmakobiologii Wydziału Farmaceutycznego Uniwersytetu Jagiellońskiego).

Przedmiotem moich zainteresowań naukowych są polimery ze śladem molekularnym (ang. molecularly imprinted polymers, MIPs). Proces tworzenia MIPs określany jako imprintacja molekularna polega na polimeryzacji monomerów funkcyjnych i czynnika sieciującego w obecności molekuły nazywanej wzorcem. Efektem syntezy jest polimer, który specyficznie i selektywnie wychwytuje wzorzec lub jego analogi strukturalne. MIPs są stabilne chemicznie i termicznie oraz odporne na działanie różnych czynników fizykochemicznych (np. wysokie ciśnienie, różnego rodzaju promieniowanie). Dzięki swoim właściwościom polimery ze śladem molekularnym są stosowane m.in. w metodach analitycznych (juko sorbenty w ekstrakcji do fazy stałej, sensory, wypełnienia kolumn chromatograficznych), jako systemy uwalniające leki, katalizatory w syntezie. W swoich pracach zajmuję się symulacjami układów prepolimeryzacyjnych, polimerów, procesu adsorpcji oraz teoretyczną analizą oddziaływań decydujących o rozpoznaniu molekularnym w układach MIPs. Prowadzę również prace eksperymentalne polegające na syntezie oraz badaniach właściwości MIPs.
Pomimo korzystnych właściwości tradycyjnych MIPs (otrzymywanych metodą polimeryzacji w bloku lub strąceniowej) istnieją ograniczenia w ich zastosowaniu związane z czasochłonną separacją właściwego złoża czy pozostawaniem wzorca w matrycy polimerowej po procesie obróbki. Jednym ze sposobów na pokonanie tych trudności może być otrzymanie magnetycznych molekularnie drukowanych polimerów (ang. magnetic molecularly imprinted polymers, MMIPs). Wyizolowanie ich z mieszaniny reakcyjnej nie wymaga odwirowywania i filtracji i jest łatwiejsze niż w przypadku tradycyjnych polimerów dzięki możliwości użycia zewnętrznego pola magnetycznego. Zewnętrzne pole magnetyczne upraszcza aplikację MMIPs podczas separacji związków oraz jako nośników leków do docelowego miejsca w organizmie.
Niniejszy projekt obejmuje badania wstępne dotyczące otrzymywania i analizy właściwości MMIPs. W ramach projektu mam zamiar otrzymać MMIPs przeznaczane do separacji amin biogennych. W pierwszym etapie wykonana zostanie synteza tlenku żelaza (II) diżelaza (III) (Fe3O4). Następnym krokiem będzie modyfikacja powierzchni cząstek magnetycznych (ang. magnetic nanoparticles, MNPs). W tym celu MNPs zostaną pokryte warstwą SiO2 z zastosowaniem tetraetoksysiloksanu, a następnie sfunkcjonalizowane za pomocą odpowiedniego silanu i ewentualnie surfaktantu. W kolejnym etapie wykonana zostanie synteza odpowiednich polimerów ze śladem molekularnym wybranego wzorca. Jako wzorca użyję NN-ditnetylo-2- fenyloetyloaminy, która jest analogiem strukturalnym aminy biogennej - hordeniny 4-(2-dimetyloaminoetylo)fenolu. Zamierzam otrzymać cztery polimery ze śladem molekularnym z wykorzystaniem różnych monomerów funkcyjnych: kwasu akrylowego, metakrylowego, 4-winylobenzoesowego i itakonowego. Ostatnim procesem będzie usunięcie wzorca poprzez ekstrakcję w aparacie Soxhleta. Część analityczna będzie obejmowała analizę pojemności adsorpcyjnej i powinowactwa otrzymanych polimerów do hordeniny. W analizie właściwości adsorpcyjnych wykorzystam metodę stacjonarną. Do dalszych badań wybiorę jeden polimer, wykazujący najkorzystniejsze właściwości (największe powinowactwo do analitu oraz największą pojemność adsorpcyjną). Wyznaczę parametry fizykochemiczne wybranego polimeru, takie jak: kinetyka adsorpcji, wielkość i powierzchnia ziaren, skład chemiczny, właściwości magnetyczne, wykonam analizę termograwimetryczną. Zoptymalizuję proces adsorpcji badając wpływ pH, temperatury, siły jonowej roztworu na zdolność adsorpcji analitu na imprintowanym polimerze. Zbadam selektywność polimeru w stosunku do różnych związków biogennych (tyraminy, synefryny, oktopaminy, tryptaminy, tyrozyny) oraz zdolność polimeru do adsorpcji hordeniny w próbkach modelowych i biologicznych.
Hardenina została wybrana jako docelowy analit ze względu na to, że według mojej najlepszej wiedzy, nie ma doniesień literaturowych na temat polimerów drukowanych molekularnie do selektywnej adsorpcji tej aminy biogennej. Jednocześnie hordenina wpływa na funkcjonowanie organizmu: stymuluje uwalnianie gastryny, wywołuje inhibicję monoaminooksydazy B, a także hamuje melanogenezę w ludzkich melanocytach. W związku z możliwością jej spożycia w owocach, ziołach i suplementach diety istnieje potrzeba monitorowania jej stężenia we krwi oraz w moczu. Najczęściej opisywaną w literaturze metodą oznaczania ilościowego hordeniny jest HPLC-UV, która wymaga izolowania związku i eliminowania matrycy metodą ekstrakcji do fazy stałej. Niestety dostępne handlowa sorbenty nie spełniają swojej roli w przypadku ekstrakcji hordeniny. Dlatego istnieje konieczność znalezienia selektywnego sorbentu, który pozwoli na prostą i efektywną ekstrakcję analizowanej aminy z próbek złożonych, jednocześnie niwelując wpływ matrycy biologicznej na dalsze ilościowe oznaczenia.
Spodziewanym efektem działania opisanego w projekcie będzie poszerzenie wiedzy na temat MMIPs, związków interferujących oraz procesu imprintacji molekularnej amin. Uzyskany MMIP ułatwi prowadzenie ilościowych oznaczeń hordeniny w próbkach biologicznych. Otrzymane wyniki badań wstępnych pomogą opracować optymalne warunki do otrzymania i analizy MMIPs przeznaczonych do separacji różnych analitów oraz będą pomocne podczas dalszych prac dotyczących otrzymywania postaci leków umożliwiających uwalniane substancji czynnej w określonym miejscu lub organie w organizmie.

Moje zainteresowania naukowe obejmują patogenezy miażdżycy, koncentruję się głównie na określeniu jej molekularnych mechanizmów. Głównym celem realizowanych przeze mnie badań jest opracowanie skutecznych metod profilaktycznych i terapeutycznych. Moje dotychczasowe badania koncentrowały się na ocenie wpływu czynników proaterogennych na dysfunkcji; śródbłonka naczyniowego. Obejmują one oceny roli stresu oksydacyjnego w aktywacji procesu zapalnego w komórkach śródbłonka poprzez indukcję ekspresji cząsteczek adhezyjnych (ICAM, VCAM), czynników chemotaktycznych (MCP-1) a także aktywację ścieżek sygnałowych kinaz, aktywowanych mitogenami (ERK, JNK, p38) oraz czynnika jądrowego - KB
Celem prowadzonych badań jest ocena ekspresji oraz funkcji receptorów odporności wrodzonej w rozwoju stanu zapalnego w komórkach śródbłonka. Badania będą prowadzone z wykorzystaniem:
- hodowli komórkowych - komórki śródbłonka z żył pępowinowych (HUVEC),
- preparatów blaszek miażdżycowych (N 40) materiał obecnie zebrany od pacjentów z tętnicy szyjnej podczas planowej endarektomii otwartej — badania będą wykonywane we współpracy z Kliniką Otorynolaryngologii Wydziału Lekarsko-Dentystycznego Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego (zgoda komisji bioetycznej KB/92/2008) - dysponujemy charakterystyką kliniczną tych pacjentów.
Realizacja badan obejmuje:
- określenie poziomu ekspresji receptorów: TLR 2, TLR 4, TLR 7, TLR 9, RAGE oraz białka H1MGB1 i czynnika jądrowego - KB w komórkach śródbłonka z żył pępowinowych (HUVEC) przed i po stymulacji ligandami badanych receptorów za pomocą cytometrii przepływowej
- ocenę wpływu inhibitorów poszczególnych receptorów na stymulowaną ligandami ekspresję czynnika jądrowego KB, białka HMGB1 (cytometria przepływowa) oraz ekspresję IL-6 w komórkach śródbŁonka (test Elisa)

- ocena ekspresji receptorów TLR 2, TLR 4, TLR 7, TLR 9, RAGE oraz białka H1MGB1 i czynnika jądrowego - KB w blaszce miażdżycowej za pomocą immunohistochemii

Dostępne dane naukowe wskazują na istotną rolę receptorów odporności wrodzonej, tj.: receptory toll- podobne (TLR) oraz. receptory dla zaawansowanych końcowych produktów glikacji (RAGE) w patogenezie miażdżycy. Niewłaściwa aktywacja tych receptorów powoduje zakłócenia homeostazy organizmu. Brak sygnalizacji z udziałem tych receptorów naraża organizmu na atak patogenny, natomiast nadmierna aktywacja powoduje niekontrolowane uwalnianie wielu cytokin prozapalnych oraz chemokin prowadząc do rozwinięcia stanu zapalnego, co z kolei nasila rozwój procesu miażdżycowego. Głównym wyzwaniem dla przyszłej, skutecznej terapii celowanej u pacjentów z miażdżycą jest zahamowanie procesu zapalnego związanego z tą chorobą bez wpływu na odporność wrodzoną organizmu. Toteż istotne znaczenie ma poznanie dróg transdukcji sygnału i funkcji poszczególnych receptorów odporności wrodzonej oraz. roli ich selektywnych inhibitorów. Pozwoli to na kontrolę odpowiedzi immunologicznej i blokowanie procesów negatywnych dla gospodarza. Obecnie dysponujemy jedynie wybiórczymi danymi w tym zakresie i konieczne jest przeprowadzenie badań dokumentujących wpływ hamowania aktywności tych receptorów na rozwój miażdżycy.
Planowane badania dostarczą istotnych i brakujących informacji na temat roli receptorów odporności wrodzonej w indukcji stanu zapalnego w komórkach śródbłonka. Zostanie udokumentowany wpływ selektywnych inhibitorów tych receptorów czego elektem będzie wskazanie możliwości zastosowania tych inhibitorów w leczeniu stanów zapalnych, co umożliwi kontrolę odpowiedzi immunologicznej i blokowanie procesów zapalnych bez wpływu na naturalną barierę ochronną organizmu. Ocena stopnia nasilenia stanu zapalnego poprzez określenie ekspresji wybranych receptorów w blaszce miażdżycowej pobranej od pacjentów z tętnicy szyjnej dostarczy nowych danych na temat roli tych receptorów w regulowaniu procesów zapalnych Przeprowadzone badania będą podstawą do opracowania nowych, skutecznych strategii terapeutycznych w profilaktyce oraz leczeniu miażdżycy.

Modyfikacja stylu życia za pomocą diety, regularnych ćwiczeń i kontroli wagi, jest podstawowym sposobem obniżania poziomu trójglicerydów i glukozy, a w badaniach udowodniono skuteczność takich zmian w prewencji i wspomaganiu leczenia chorób związanych z zespołem metabolicznym. Z powodu wysokich kosztów ich leczenia, zarówno w odniesieniu do życia ludzkiego jak i względów ekonomicznych, poszukiwanie bezpiecznych i skutecznych czynników naturalnych wspierających ich terapię wydaje się być wysoce pożądane. Jednym z celów terapeutycznych leczenia otyłości i innych chorób związanych z zespołem metabolicznym jest zahamowanie trawienia i wchłaniania składników odżywczych, takich jak tłuszcze i węglowodany, poprzez hamowanie działania enzymów trawiennych. Z tego powodu, kluczową rolę w tego typu schorzeniach odgrywa przewód pokarmowy i bariera jelitowa. Warstwa komórek nabłonka jelitowego stanowi złożony układ obronny oddzielający zawartość jelit od tkanek gospodarza, jak również zawiera komórki układu odpornościowego. Integralność tego układu jest niezbędna do utrzymania normalnej przepuszczalności jelitowej, gdyż jej zaburzenie prowadzi do przepływu zawartości światła jelita do krążenia (przeciek bariery jelitowej) i rozwoju stopniowo narastającego przewlekłego stanu zapalnego w tkankach. Uważa się, że wzrost przepuszczalności jest podstawą patogenezy wielu chorób, takich jak zapalenie jelita, zespół jelita drażliwego, choroby autoimmunologiczne (celiakia, zmiany atopowe), cukrzyca typu I, ostre zapalenie trzustki, marskość wątroby, jak również stwardnienie rozsiane i reumatyzm. Nawet choroby niezwiązane bezpośrednio z funkcjami śluzówki, takie jak niewydolność serca czy zawał mięśnia sercowego, są prawdopodobnie nasilane w przypadku zwiększonej przepuszczalności śluzówki. Dlatego zapobieganie przeciekom bariery jelitowej lub zapaleniu jelita przez preparaty pochodzenia roślinnego lub surowce roślinne bogate w związki bioaktywne nabiera znaczenia prewencyjnego. Niniejszy wniosek próbuje wskazać korzystną rolę leczniczych i tradycyjnych przetworów roślinnych, które są często wykorzystywane szczególnie w krajach Europy środkowej. Z powodu powszechnego stosowania w postaci herbat ziołowych, marmolad, dżemów, galaretek i napojów, wydaje się być uzasadnionym poszukiwanie wśród tych surowców związków hamujących wchłanianie niektórych składników diety. Spośród ogólnodostępnych składników dietetycznych, znaczną rolę odgrywają produkty pozyskiwane z szyszek chmielu, owoców aronii, dzikiego bzu czarnego, pigwowca, derenia czy dzikiej róży, a także kwiatów hibiskusa i orzechów laskowych. Inne, jak owoce rokitnika, berberysu, jarzębiny czy żołędzie coraz częściej zyskują na znaczeniu. Ziele bylicy draganek oraz nasiona czarnuszki służą z kolei jako przyprawy kulinarne. W kontekście poszukiwania czynników o wielokierunkowym działaniu w prewencji zespołu metabolicznego wśród gatunków roślin bogatych w związki bioaktywne, na podstawie oceny obniżania aktywności enzymów związanych z hamowaniem trawienia tłuszczów i węglowodanów zostanie przeprowadzona wstępna selekcja wybranego do badań materiału. Najbardziej aktywne wyciągi zostaną poddane kolejnym etapom sztucznego procesu trawienia. W związku z tym możliwe będzie wskazanie składników pochodzenia roślinnego, które faktycznie docierają do jelita grubego. Ostatecznie, w projekcie planowane jest przeprowadzenie badań z użyciem modelu ludzkich komórek jelita grubego – linii komórkowej Caco-2 rosnącej w monowarstwie – który jest stosowany do oceny wchłaniania związków w warunkach in vitro. Najnowsze badania donoszą o interesującej kwestii sygnałów wysyłanych przez jelitową florę bakteryjną, jak również interakcji flory bakteryjnej ze śluzówką jelita. Uważa się, że interakcja bakterie-nabłonek jest ważna dla utrzymania homeostazy jelitowej i ma ogromny wpływ na układ odpornościowy gospodarza. Projekt ma na celu wyjaśnić rolę surowców roślinnych w utrzymaniu szczelności ściany jelita i ochronie śluzówki, szczególnie przeciwko czynnikom wydzielanym przez bakterie patogenne, które mogą przenikać do krwioobiegu i wywoływać odpowiedź immunologiczną. Co więcej, badanie pozwoli na określenie, które składniki wyciągów ulegają wchłonięciu i czy mają też działanie przeciwzapalne. Wzrastająca świadomość pacjentów jest widoczna we wzroście dystrybucji probiotyków na rynku farmaceutycznym, nie tylko w związku z antybiotykoterapią. Coraz częściej probiotyki są polecane w celu zmniejszenia częstości występowania i nasilenia biegunki u dzieci, jak i chorób układu autoimmunologicznego (atopowe zapalenie skóry). Panuje pogląd, że niedojrzała warstwa kosmków jelitowych noworodków jest podstawową drogą inwazji alergenów. Produkty naturalne mogą wzmacniać funkcje fizjologicznej bariery między florą bakteryjną a jelitem, jak również chronić przed czynnikami patogennymi. Taki efekt prawdopodobnie przekłada się na korzyści zdrowotne od dzieciństwa do dorosłości. Stosowanie błonnika i związków naturalnych, szczególnie polifenoli, oraz przetworów bogatych w polifenole, używanych w życiu codziennym w postaci herbat i napojów, może stanowić skuteczne wsparcie dla konwencjonalnej terapii i prewencji chorób cywilizacyjnych. Ponadto należy zwrócić uwagę na bezpieczeństwo tych preparatów w porównaniu z lekami stosowanymi długoterminowo w terapii chorób metabolicznych. W szczególności pacjenci zniechęceni do terapii konwencjonalnej z powodu działań niepożądanych leków syntetycznych zwykle wybierają produkty naturalne. W przyszłości rozwiązanie przedstawionego zagadnienia może mieć zatem duże znaczenie prewencyjne. Mając na uwadze, że profilaktyka zapewnia więcej korzyści niż leczenie, ten rodzaj działania na poziomie jelita wydaje się korzystny zarówno dla pacjentów jak i systemu opieki zdrowotnej.

Głównym celem tego projektu jest opracowanie nowych krystalicznych fosforanów wapnia wzbogaconych w różnorodne jony o potencjalnym znaczeniu biomedycznym. Następnym podstawowym celem projektu jest opracowanie materiałów dwu- i wielofazowych o różnej charakterystyce uwalniania tych jonów.
Badania podstawowe realizowane w ramach projektu: Synteza różnych krystalicznych fosforanów wapnia (hydroksyapatytu (HA), ortofosforanów wapnia (βTCP oraz αTCP) wodorofosforanów wapnia (bezwodnego CaHPO4 (DCPA) oraz dwuwodnego CaHPO4∙2H2O (DCPD)) zawierających domieszki „obcych” jonów: kationów I, II lub III-wartościowych (np. K+ , Ag+ , Zn2+, Mn2+, Mg2+, Cu2+, Ga3+) oraz różnorodnych anionów (np. SeO3 2- , SeO4 2- , SiO4 4- , BO3 3- ). Zbadanie struktury i składu chemicznego otrzymanych podstawionych materiałów fosforanowowapniowych oraz badania fizykochemiczne tych materiałów. Planowane metody badawcze: rentgenowska dyfraktometria proszkowa (PXRD), spektroskopia w średniej podczerwieni (FT-IR), spektroskopia Ramana (R), spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego w ciele stałym (ssNMR), atomowa spektrometria absorpcyjna (ASA), fluorescencja rentgenowska z dyspersją fali (WD XRF) oraz spektrometria emisyjna ze wzbudzeniem plazmy (ICP OES). Analiza uwalniania jonów z otrzymanych materiałów (metoda spektrometrii mas ze wzbudzeniem plazmy ICP MS). Opracowanie materiałów dwu- oraz wielofazowych opartych o otrzymane podstawione materiały fosforanowo-wapniowe charakteryzujących się różną szybkością uwalniania obcych jonów. Ocena właściwości biologicznych otrzymanych materiałów. Powody podjęcia tematyki badawczej: Fosforany wapnia stanowią grupę nieorganicznych materiałów o istotnym znaczeniu w implantologii, medycynie regeneracyjnej oraz stomatologii. W ludzkich tkankach zmineralizowanych (tj. kościach, szkliwie, zębinie czy cemencie zębowym) nieorganicznym budulcem zapewniającym im twardość jest tzw. apatyt biologiczny czyli nanokrystaliczny hydroksyapatyt węglanowy zawierający wiele różnorodnych podstawień jonowych. Dlatego też syntetyczne materiały kościozastępcze, powłoki implantów metalicznych, cementy dokostne czy materiały stomatologiczne często zawierają w swym składzie fosforany wapnia, które zapewniają biokompatybilność, bioaktywność i niską cytotoksyczność. Od wielu lat najpopularniejszy wśród syntetycznych fosforanów wapniowych, hydroksyapatyt (HA) o wzorze sumarycznym Ca10(PO4)6(OH)2, a jednocześnie najsłabiej resorbowalny, skutecznie poddaje się domieszkowaniu różnymi jonami w celu wzbogacenia go o dodatkowe właściwości biologiczne, fizykochemiczne czy też mechaniczne. Z kolei bardzo mało jest wiadomo na temat możliwości podstawień jonowych w innych krystalicznych fosforanach wapniowych, np. ortofosforanie wapnia Ca3(PO4)2 (forma βTCP oraz αTCP), krystalicznym bezwodnym wodorofosforanie wapnia CaHPO4 (DCP) oraz dwuwodnym wodorofosforanie wapnia CaHPO4∙2H2O (DCPD). Nieliczne badania nad wzbogaceniem βTCP oraz αTCP pokazują, że takie materiały charakteryzują się lepszą rozpuszczalnością i szybszym uwalnianiem obcych jonów niż podstawione apatyty. Obecnie w medycynie stosuje się materiały dwufazowe (najczęściej zawierające czysty, niepodstawiony HA oraz βTCP w różnych proporcjach), które zapewniają lepszą bioaktywność i łatwiejszą osteointegrację. Zaplanowane w naszym projekcie opracowanie nowych podstawionych fosforanów wapnia ma na celu poszerzenie wiedzy w zakresie wymiany jonowej w wybranych krystalicznych fosforanach wapnia. Chcemy opracować materiały charakteryzujące się różną resorbowalnością i różną szybkością uwalniania jonów. Spodziewamy się, że wyniki zaplanowanych przez nas badań będą szczególnie ważne dla postępu biologii, medycyny i inżynierii materiałowej (projektowanie materiałów kościozastępczych).

Celem planowanych badań jest powiązanie aktywności systemów pomp odpowiedzialnych za oporność wielolekową (MDR) z profilami lekooporności szczepów klinicznych Stenotrophomonas maltophilia oraz poszukiwanie nowych systemów efflux obecnych u tego gatunku. Obecnie główne badania nad chorobotwórczością pałeczek Gram-ujemnych dotyczą szczepów z rodziny Enterobacteriaceae. Jednakże rola szczepów innych gatunków w chorobotwórczości również gwałtownie rośnie. Stenotophomonas maltophilia jest jedną z najczęściej izolowanych pałeczek Gramujemnych odpowiedzialnych za zakażenia szpitalne. Jest patogenem oportunistycznym, szczególnie niebezpiecznym dla pacjentów z obniżoną odpornością, rozległymi oparzeniami, długotrwale hospitalizowanych, chorych na mukowiscydozę. Szczepy S. maltophilia wywołują wiele poważnych zakażeń, w tym zapalenia płuc, zapalenia opon mózgowych, posocznice, które mogą osiągnąć, jak w przypadku bakteriemii, współczynnik śmiertelności nawet 69%. Zakażenia S. maltophilia stanowią bardzo poważny problem terapeutyczny z uwagi na szeroko występującą oporność tych szczepów na różne rodzaje antybiotyków i chemioterapeutyków. Obecność pomp MDR (multi-drug resistance) jest jednym z najbardziej istotnych mechanizmów oporności S. maltophilia. Pompy MDR są zdolne do usuwania różnych klas antybiotyków, chemioterapeutyków i środków dezynfekcyjnych na zewnątrz komórek bakterii. W badaniach wstępnych wykazano powszechne występowanie wśród badanych izolatów S. maltophilia systemów efflux z rodziny ABC i niektórych pomp z rodziny RND. Biorąc pod uwagę mnogość systemów pomp wielolekooporności u blisko spokrewnionego gatunku Pseudomonas aeruginosa należy poszukiwać nowych systemów wielolekooporności także u szczepów S. maltophilia. Badania będą obejmować grupę ponad 100 szczepów S. maltophilia wyizolowanych od pacjentów hospitalizowanych w warszawskich szpitalach. W ramach prowadzonych prac będą poszukiwane geny kodujące systemy pomp z rodziny RND oraz zostanie określony udział wybranych systemów w oporności szczepów przy zastosowaniu testów lekowrażliwości oraz metody real-time RT-qPCR. Sekwencjonowanie DNA genomowego wybranych szczepów o nietypowym fenotypie oporności umożliwi odkrycie nowych systemów efflux obecnych u S. maltophilia. Każdego roku obserwuje się coraz większą liczbę szczepów S. maltophilia opornych na związki stosowane w terapii zakażeń. Wzrasta także liczba osób z obniżoną odpornością podatnych na zakażenia S. maltophilia. Są to bardzo niepokojące zjawiska, które wymagają ciągłego poszerzania wiedzy o patogenach oportunistycznych, a także genach i mechanizmach oporności. Do tej pory, w Polsce nie prowadzono żadnych badań dotyczących pomp MDR występujących u klinicznych izolatów S. maltophilia, badania światowe są fragmentaryczne. W prezentowanym projekcie zostaną one przeprowadzone po raz pierwszy, co więcej, na tak szeroką skalę – będą obejmować wszystkie opisane do tej pory systemy pomp MDR z rodzin RND i ABC, oraz zostaną wykonane z udziałem dużej grupy szczepów. Proponowane badania umożliwią dogłębną charakterystykę szczepów i dostarczą wiedzy na temat sytuacji epidemiologicznej i oporności szczepów w Polsce. Umożliwią też porównanie cech szczepów polskich ze szczepami izolowanymi w różnych rejonach świata. Przeprowadzone sekwencjonowanie DNA genomowego wyselekcjonowanych szczepów umożliwiające odkrycie nowych systemów efflux będzie poszerzało światową wiedze o mechanizmach oporności szczepów S. maltophilia. Ponadto uzyskane dane poszerzą wiedzę użyteczną w terapii zakażeń S. maltophilia nie tylko w Polsce, ale także będą wskazówką co do prawdopodobieństwa procentowego udziału nadekspresji systemów MDR w lekooporności szczepów tej pałeczki w innych rejonach świata.

1. Cel prowadzonych badań/hipoteza badawcza
Zespoły padaczkowe, których podłoże molekularne stanowią mutacje genu SCN1A kodującego podjednostkę a potencjałozależnego kanału jonowego Na+ (Nayl.l) stanowią grupę jednostek chorobowych o dużej zmienności fenotypowej. Są to zarówno padaczki o stosunkowo łagodnym obrazie klinicznym, jak i katastroficzne encefalopatię padaczkowe, np. zespół Dravet. Do tej pory nie ustalono zależności pomiędzy rodzajem i lokalizacją mutacji w genie SCN1A a obrazem klinicznym obserwowanego zespołu, w zdecydowanej większości przypadków nie wiadomo też jakie funkcje potencjałozależnego kanału jonowego Na+ ulegają zaburzeniu w poszczególnych przypadkach choroby. Biorąc pod uwagę fakt zmienności obrazu klinicznego dla konkretnych mutacji, nawet u osób spokrewnionych można postawić hipotezę, że fenotyp pacjenta (typ zespołu padaczkowego) jest wynikiem rodzaju patologii molekularnej i zaburzenia funkcjonalnego podjednostki Nayl.l, na co nakładać się może wpływ czynników modyfikujących ostateczny obraz kliniczny choroby.
Celem niniejszego projektu jest zbadanie metodami in vitro, oraz przyżyciową związków pomiędzy rodzajem mutacji SCNIA a zaburzeniami funkcji potencjałozależnych kanałów jonowych Na+, oraz wpływu potencjalnych genetycznych modyfikatorów na obraz kliniczny choroby. Wyniki pozwolą także na poznanie osobniczej heterogenności genetycznej w obrębie genów kodujących inne kanały jonowe u pacjentów z populacji polskiej a także ich wpływ na zmienność fenotypu analizowanych zespołów padaczkowych.
2. Zastosowana metoda badawcza/metodyka
Wybrane mutacje genu SCNIA stwierdzane u pacjentów z zespołem Dravet, odtworzone w cDNA genu SCNIA poddane zostaną ekspresji w modelowych nieneuronalnych komórkach HEK tsA201. Potencjałozależne prądy jonowe Na+ w tych komórkach zbadane zostaną przy użyciu techniki voltage-clamp w celu określenia właściwości kintycznych prądów jonowych Na + występujących w różnych typach mutacji genu SCNIA. U pacjentów przeprowadzone zostanie badanie pobudliwości błony nerwów obwodowych które pozwoli na wykazanie, czy dysfunkcje kanałów jonowych Na+ są uchwytne klinicznym badaniem neurofizjologicznym i czy wyniki tego badania wykazują korelację z wynikami doświadczeń voltage-clamp. W celu identyfikacji czynników wpływających na zależny od mutacji genu SCNIA fenotyp, przeprowadzona zostanie, z zastosowaniem eksomowego sekwencjonowania następnej generacji, analiza zmienności genów kodujących kanały jonowe które mogą wpływać na funkcję potencjałozależnych kanałów jonowych Na', a więc stanowić genetyczne modyfikatory przebiegu zespołu padaczkowego.
3. Wpływ spodziewanych rezultatów na rozwój nauki, cywilizacji, społeczeństwa
Wykonanie badań przewidzianych w ramach projektu pozwoli na pogłębienie wiedzy na temat molekularnego i funkcjonalnego podłoża genetycznie uwarunkowanych wczesnodzieciecych encefalopatii padaczkowych, w szczególności w kontekście przeniesienia patologii molekularnej na zaburzenia funkcjonalne potencjałozależnego kanału Na+ i ich korelacji z fenotypem.

Celem projektu jest zbadanie ekspresji i charakterystyka właściwości biofizycznych kanałów jonowych Na+ typu NaV1.9 i porównanie tych właściwości w neuronach piramidowych warstwy V kory przedczołowej (PFC) szczurów w różnym wieku. Uważa się, że za zachowanie organizmu oraz zmiany zachowania organizmu związane z wiekiem jest odpowiedzialne prawidłowe funkcjonowanie neuronów PFC. Zaburzone działanie PFC jest przyczyną większości zależnych od wieku chorób neuropsychiatrycznych, które występują u 34% obywateli Unii Europejskiej. Fizjologiczna i patofizjologiczna aktywność neuronów PFC zależy, między innymi, od ekspresji i właściwości biofizycznych kanałów jonowych występujących w tych neuronach. Ostatnio wykazaliśmy, że istotną rolę w regulacji aktywności neuronów PFC mogą odgrywać kanały jonowe TTX-niezależne typu NaV1.9. Badania elektrofizjologiczne zostaną przeprowadzone na neuronach piramidowych warstwy V części przyśrodkowej PFC, zlokalizowanych w skrawkach wyizolowanych od samców szczurów młodych (18-22 dni), w okresie dojrzewania (38-42 dni), dorosłych (60-65 dni) i być może starych (20-miesięcznych). Płaty czołowe zostaną pocięte na skrawki. Neurony piramidowe będą identyfikowane w świetle podczerwonym i DIC. Rejestracje pojedynczych prądów jonowych kanałowych Nav1.9 zostaną przeprowadzone z ciała komórkowego neuronów metodą stabilizacji potencjału na powierzchni łatki. Zostanie określone m. in. prawdopodobieństwo otwarć, średni czas otwarć, amplituda, aktywacja, inaktywacja zależna od potencjału oraz od czasu badanych prądów jonowych kanałowych. Analiza wyników zostanie przeprowadzona za pomocą programu Clampfit 9.0 oraz standardowych testów statystycznych. Neurony zlokalizowane w skrawkach szczurów młodych (18-22 dniowych), w wieku dojrzewania (38-42 dniowych), dorosłych (58-62 dniowych) i starych (20 miesięcznych) otrzymanych z utrwalonych mózgów będą znakowane Map2. Ekspresja kanałów jonowych Nav1.9 zostanie zbadana metodą immunofluorescencji przy wykorzystaniu mikroskopu konfokalnego w neuronach piramidowych identyfikowanych na podstawie kształtu (trójkątny kształt, obecność apikalnego dendrytu, występowanie dendrytów bazalnych). Zostaną porównane właściwości biofizyczne oraz ekspresja kanałów jonowych Nav1.9 u szczurów w różnym wieku. Próg pobudzenia potencjałozależnych kanałów jonowych Na+ typu NaV1.9 jest zbliżony do wartości potencjału błonowego spoczynkowego. W związku z tym zmniejszenie lub zwiększenie prawdopodobieństwa otwarć tych kanałów (wywołane przez związki biologicznie czynne, neuroprzekaźniki) wywołuje, odpowiednio, hiperpolaryzację lub depolaryzację błony komórkowej neuronów i tym samym zmienia pobudliwość neuronów. W neuronach piramidowych występują depolaryzacje potencjału błonowego spoczynkowego. Depolaryzacje te powodują wzrost pobudliwości neuronów będący funkcjonalnym podłożem pamięci operacyjnej. Zaburzenie tych depolaryzacji występuje w padaczce, schizofrenii i w naturalnym lub przyspieszonym starzeniu się ośrodkowego układu nerwowego. Efektor komórkowy odpowiedzialny za powstawanie tych depolaryzacji nie jest zdefiniowany. Wyniki uzyskane w naszej i w innych pracowniach wskazują, że za depolaryzacje neuronów piramidowych PFC może być odpowiedzialna aktywacja kanału Nav1.9. Celem tego projektu jest zarejestrowanie prądów jonowych kanałowych typu Nav1.9 oraz zdefiniowanie ich właściwości biofizycznych w neuronach piramidowych warstwy V PFC szczurów w różnym wieku. Identyfikacja oraz poznanie mechanizmów działania kanałów jonowych Na+ typu NaV1.9 na poziomie komórkowym jest podstawą do zrozumienia mechanizmów odpowiedzialnych za zmiany zachowania organizmu w czasie rozwoju osobniczego oraz do wprowadzenia optymalnej terapii i racjonalnej konstrukcji leków usprawniających i korygujących dysfunkcję aktywności neuronów piramidowych kory przedczołowej.

Celem projektu jest jakościowa i ilościowa analiza związków występujących w owocach aronii czarnoowocowej (Aronia melanocarpa), takich jak antocyjany, procyjanidyny i kwasy hydroksycynamonowe. Ich zawartość zmienia się w trakcie dojrzewania, zależy od czasu zbioru i położenia geograficznego plantacji. Nowością w naszym projekcie jest zastosowanie spektroskopii NMR w połączeniu z metodami chemometrycznymi (analiza głównych składowych PCA, metoda cząstkowych najmniejszych kwadratów PLS) do oznaczania składu ekstraktów i soków. Rezultatem będzie baza danych w postaci parametrów NMR, która pozwoli na analizę profilu metabolitów bez potrzeby rozdzielania mieszaniny. Badane będą również właściwości antyoksydacyjne ekstraktów i soków z aronii, a następnie analizowane przy użyciu chemometrii w celu ustalenia głównych związków odpowiedzialnych za te efekty. Szczególnym ważnym zadaniem będzie badanie, czy wyciągi z aronii lub wybrane związki wykazują działanie przeciwzapalne na komórki śródbłonka, a tym samym posiadają potencjalne właściwości przeciwmiażdżycowe. Dodatkowo zostaną zbadane mechanizmy leżące u podstaw wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych. Dane uzyskane z badania komórek śródbłonka z zastosowaniem chemometrii pozwolą określić związki odpowiedzialne za działanie biologiczne ekstraktów aronii.
Próbki owoców Aronia melanocarpa będą zbierane w ciągu trzech sezonów od lipca do października na przemysłowych, ekologicznych uprawach w Polsce. Owoce zostaną w większości zliofilizowane, częściowo przetworzone na sok. Z liofilizowanych próbek będą wykonane ekstrakty, których skład chemiczny będzie określony za pomocą spektroskopii NMR (1H / 13C NMR w roztworze) z wykorzystaniem analizy chemometrycznej. Znane metody chemometryczne zostały zastosowane i rozwinięte w naszym Zakładzie. Widma NMR będą zarejestrowane się na spektrometrze Bruker 400MHz. Ponieważ widma NMR procyjanidyn w mieszaninie są trudne do interpretacji, potrzebne będzie wsparcie metod chromatograficznych. Analiza jakościowa i ilościowa zostanie przeprowadzona przy użyciu systemu HPLC z detektorem z matrycą diodową (DAD-HPLC), zgodnie z opublikowanymi procedurami. Zakup aparatury HPLC-DAD planowany jest ze środków finansowych projektu. Wszystkie ekstrakty zostaną przebadane pod kątem właściwości antyoksydacyjnych: ORAC, FRAP oraz DPPH i lag-phase przy zastosowaniu spektrometrii EPR. Metoda EPR szczególnie dobrze nadaje się do pomiaru próbek kolorowych (np. ciemnoczerwonych), a także nieprzezroczystych. Widma EPR będą rejestrowane na spektrometrze EPR 9,3 GHz MiniScope (Magnettech). Badania właściwości przeciwzapalnych zostaną przeprowadzone na ludzkich komórkach śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC). Ekspresja cząsteczek adhezyjnych z wykorzystaniem przeciwciał ICAM-1 i VCAM-1 będzie mierzona metodą cytometrii przepływowej. Wydzielanie protein MCP-1 i IL-6, będzie wykonane za pomocą zestawu ELISA. W celu określenia poziomu mRNA dla ICAM, VCAM, MCP-1 i IL-6 zostanie przeprowadzona ilościowa analiza łańcuchowej reakcji polimerazy w czasie rzeczywistym (real-time PCR) na zestawie LightCycler. Będzie również badana generacja wewnątrzkomórkowych reaktywnych form tlenu i rodnika ponadtlenkowego. Zostanie oceniona fosforylacja białek p38 MAPK, ERK1/2, JNK i NF-kB p65 oraz zmierzony poziom białka p65 we frakcji jądrowej za pomocą Trans NF-kB zestaw p65.
Polska ma największy na świecie areał upraw aronii, a konsumpcja tych owoców może przyczynić się do poprawy zdrowia obywateli UE. Nasze badania stanowią wkład w dokumentację oświadczeń zdrowotnych EFSA dla produktów aroniowych, co umożliwi ich promocję jako pro-zdrowotnego produktu. Zastosowanie ekstraktów roślinnych jako żywności, suplementów diety lub leków ziołowych wymaga ich zbadania takimi metodami analitycznymi, które pozwalają na badanie złożonych mieszanin. Takie możliwości zapewnia spektroskopia NMR, zwłaszcza jeśli metabolomika połączona jest z analizą chemometryczną. Wyniki projektu pozwolą na standaryzację produktów aroniowych, takich jak soki czy ekstrakty, przy jednoczesnej optymalizacji ich właściwości antyoksydacyjnych. Jagody aronii charakteryzują się najwyższą wśród owoców aktywnością antyoksydacyjną (wartość ORAC > 160 μmol TE/kg), mogą być cenne w diecie. Standaryzacja ma ogromne znaczenie dla badań in vivo. Rozbieżne wyniki badań klinicznych, to rezultat faktu, że profil związków czynnych różni się w zależności od czasu zbioru, pochodzenia owoców i metod obróbki. Nasze badania pozwolą na lepsze poznanie bioaktywnych związków aronii oraz ich działania antyoksydacyjnego i przeciwzapalnego. Oczekujemy, że preparaty wytworzone w oparciu o nasze wyniki mogą znaleźć stosowanie w profilaktyce miażdżycy i chorób sercowo-naczyniowych.