Narodowe Centrum Nauki

Gut-brain-axis perspective on the impact of Cannabis flos on the blood-brain-barrier
Inflammation within the central nervous system (CNS), known as neuroinflammation, is a critical factor in the
pathogenesis of neurodegenerative diseases such as Parkinson's and Alzheimer's disease, mood disorders, e.g.
depression, anxiety, and cognitive dysfunctions. The development of inflammation in the CNS is multifaceted, but the
most commonly mentioned factors include a decline in the integrity of the blood-brain barrier and inflammation initiated
by non-neuronal microglial cells.
Recently, the bidirectional communication pathway between the gut microbiota and the CNS, known as the microbiotagut-
brain axis, has attracted increasing attention. Moreover, recent reports indicate significant changes in the diversity of
the gut microbiota in the course of neurodegenerative diseases and depression.
The diversity of the gut microbiota largely depends on many factors, not only dietary components and synthetic drugs but
also natural products and specialised plant metabolites used for their medicinal properties. On the other hand, in recent
years, more attention has been paid to the role of the gut microbiota in assessing the efficacy and mechanisms of action
of established therapies, including those based on plant-derived products. An essential aspect of research on the
pharmacokinetics and bioavailability of orally administered herbal medicines is the formation of postbiotic metabolites,
often with greater therapeutic potential compared to the parent compounds. From this perspective, including the gut
microbiota as a critical factor influencing the medicinal properties of herbal remedies offers an opportunity to fill the
knowledge gap resulting from inconsistencies between the pharmacokinetics of individual specialised plant metabolites
and the effects observed in vivo.

Natural raw materials offer promising therapeutic opportunities due to their complex structure and interaction with gut
microbiota. Cannabis sativa L. has gained particular attention due to its multifaceted therapeutic effects attributed to
cannabinoids, terpenes and flavonoids. Due to the chemical profile of Cannabis flos (CF) specialised metabolites, recent
researches focus on the potential use of this plant material in neurodegenerative diseases, e.g. Parkinson's disease, as
well as mood disorders - anxiety and depression. Although vaporisation is the most common route of CF administration,
current estimates suggest that a significant proportion (25%) of cannabis users use “edible” preparations, which may
include infusions and tinctures, as well as plant material in the form of tablets or capsules. This is especially common in
patients who cannot inhale due to lung disease, trouble handling vaporiser devices, or due to their personal preferences.
Nevertheless, the interactions of oral Cannabis flos formulations with the gut microbiota and the pharmacological
potential of their gut metabolites have not been elucidated.
Considering the unresolved question of the participation of gut microbiota in the metabolism of orally administered CF
preparations (micronised raw material, infusions, tinctures), the proposed project aims to conduct a metabolomic
assessment of postbiotic metabolites derived from oral CF formulations, produced by ex vivo intestinal microbiota
cultures and to clarify their potential in vitro activity.
This will allow us to verify the research hypothesis that Cannabis flowers may be a source of various postbiotic
metabolites that affect the blood-brain barrier and modulate neuroinflammation.
Through a comprehensive range of experimental approaches, our scientific project will allow us to understand previously
unexplored aspects concerning the chemical structures of postbiotic CF metabolites, the effect of this plant material on
the diversity and metabolism of human gut microbiota, as well as the effect of CF gut metabolites on the blood-brain
barrier and microglial cell functions. The obtained results will allow us to better understand the mechanisms of action of
CF plant material and its formulations in the context of neuroinflammatory-based diseases. Moreover, the
implementation of the project assumptions will also allow us to assess whether any of the postbiotic CF metabolites can
be used as a matrix for the development of new therapeutic agents for neuroinflammatory-based diseases.

Hipotezy oraz najważniejsze cele projektu:
1. Wytworzony eksperymentalny opatrunek na bazie nierozpuszczalnej frakcji keratyny z dodatkiem
M-CSF, będzie biokompatybilny, bioaktywny oraz biodegradowalny. Uwalnianie M-CSF do loży rany
będzie przebiegało w powtarzalny i przewidywalny sposób.
2. Proponowany opatrunek przyspieszy gojenie się rany u szczura z jatrogennie indukowaną cukrzycą
typu 2.
3. Zastosowany opatrunek korzystnie wpłynie na strukturę skóry i naskórka, co będzie potwierdzone w
badaniach histopatologicznych, immunofluorescencyjnych oraz molekularnych.
4. Eksperymentalny opatrunek wpływa na rodzaj komórek napływających do loży rany oraz zwiększa
aktywność tych szlaków sygnałowych (szczególnie szlaku PI3K/AKT/mTOR), których prawidłowe
działanie jest niezbędne do prawidłowego procesu gojenia się ran.
Badania zaplanowane w ramach tego projektu przybliżą wiedzę na temat procesów zachodzących w
trudno gojących się ranach. Dodatkowo dostarczą cennych informacji na temat wykorzystywanego
modelu cukrzycy typu 2 u szczura, jego potencjalnych zalet oraz wad. Ostatecznie mogą one
doprowadzić do wytworzenia opatrunku na rany, z udowodnioną skutecznością u szczurów z
indukowaną cukrzycą. Jest to niezbędnym, pierwszym krokiem przed wykonywaniem kolejnych badań
przedklinicznych, a w przyszłości badań klinicznych.
 

Wspomaganie funkcji ochronnych nabłonka pochwy i szyjki macicy oraz mikrobioty pochwy
przez korę oczaru i jej główny składnik – hamamelitaninę.
Mikrobiota pochwy (Vaginal microbiota – VM) jest unikalnym dla każdej kobiety zespołem
mikroorganizmów zamieszkujących dolny odcinek układu rozrodczego. W przeciwieństwie do mikrobioty
jelitowej, w której większa różnorodność jest korzystniejsza dla organizmu gospodarza, optymalna VM
powinna być zdominowana przez jeden gatunek rodzaju Lactobacillus, np. L. crispatus lub L. gasseri. Bakterie
te, żyjąc w ścisłym powiązaniu z nabłonkiem pochwy i szyjki macicy, stanowią barierę ochronną przed
patogenami i substancjami drażniącymi. Wydzielane przez nie dobroczynne substancje, jak kwas mlekowy i
bakteriocyny, zapewniają odpowiednie pH, stymulują wydzielanie śluzu, mobilizują układ odpornościowy i
wspierają funkcje barierowe nabłonka. Jednakże skład VM jest bardzo podatny na zmiany, a do kluczowych
czynników wywierających na niego wpływ zaliczamy poziom hormonów zależny od wieku i cyklu
menstruacyjnego, pochodzenie etniczne, kondycję układu odpornościowego, infekcje i stosowane terapie
przeciwbakteryjne i przeciwgrzybicze, jak również styl życia obejmujący osobistą higienę intymną, stres, dietę,
używki i zachowania seksualne.
Stan dysbiozy pochwy, w którym dochodzi do utraty dominacji przez Lactobacillus na korzyść bakterii
patogennych, dotyka niemal 30% kobiet, a kolejne 34% kobiet posiada VM o nieoptymalnym składzie. Takie
zaburzenia w składzie VM powodują podwyższony stan zapalny i zwiększenie przepuszczalności nabłonka dla
patogenów i substancji drażniących, co w konsekwencji prowadzi do poważnych działań niepożądanych, jak
zwiększone ryzyko wystąpienia chorób przenoszonych drogą płciową, zapalenie narządów miednicy
mniejszej, a nawet przedwczesnego porodu. W przypadku wystąpienia objawów klinicznych, takich jak
pieczenie, swędzenie, zaczerwienienie, upławy i nieprzyjemny zapach, najczęściej diagnozuje się bakteryjne
lub grzybicze zapalenie pochwy i sromu. Leczenie sprowadza się do podawania antybiotyków lub leków
przeciwgrzybiczych, których stosowanie nieuchronnie wiąże się z nawrotem infekcji i wzrostem oporności
drobnoustrojów. Niedoskonałości istniejących standardów terapeutycznych, brak terapii alternatywnych i
rosnące zapotrzebowanie powoduje konieczność poszukiwania skutecznych i bezpiecznych substancji
leczniczych i profilaktycznych.
Produkty naturalne od wieków stanowią źródło inspiracji w poszukiwaniu efektywnych terapii. W
medycynie tradycyjnej do leczenia schorzeń ginekologicznych, takich jak infekcje, stany zapalne i upławy,
wykorzystywano substancje roślinne bogate w garbniki. Są to wielkocząsteczkowe związki polifenolowe znane
z właściwości przeciwbiegunkowych. Dotychczas przeprowadzone badania naukowe wykazały ich korzystny
wpływ na nabłonek jelit oraz błonę śluzową jamy ustnej i nosa. Wykazały one działanie przeciwzapalne,
uszczelniające nabłonek i hamujące adhezję patogenów.
Kora oczaru (Hamamelidis cortex) pozyskiwana z oczaru wirginijskiego (Hamamelis virginiana L.) jest
substancją często stosowaną w medycynie tradycyjnej w leczeniu infekcji i podrażnień okolic intymnych.
Głównym i charakterystycznym związkiem chemicznym występującym w ekstraktach z kory oczaru jest
hamamelitanina (2’,5-di-O-galoilohamameloza). W przeprowadzonych badaniach wstępnych wykazano, że
zarówno ekstrakt, jak i wyizolowana hamamelitanina hamują stan zapalny komórek skóry – keratynocytów i
fibroblastów. Dodatkowo, hamamelitanina silnie wspiera regenerację uszkodzeń w teście gojenia ran in vitro.
Zaplanowane w projekcie badania in vitro obejmują wpływ ekstraktu i hamamelitaniny na regenerację,
przepuszczalność, integralność i stan zapalny nabłonka wywołany infekcją. Ponadto zostanie zbadany wpływ
na wzrost, aktywność metaboliczną oraz adhezję do nabłonka mikroorganizmów charakteryzujących
optymalną i nieprawidłową VM. Następnie analizy zostaną ekstrapolowane na tkankowy model 3D nabłonka
pochwy, aby zweryfikować bezpieczeństwo i skuteczność stosowania ekstraktu i hamamelitaniny w
zapobieganiu i leczeniu infekcji intymnych oraz ich objawów klinicznych.
Mimo, iż dysbioza pochwy i jej niekorzystne skutki dotykają miliony kobiet na całym świecie, skuteczne
strategie ich zapobiegania i leczenia nie zostały dotychczas opracowane. Wiąże się to z nieuzasadnioną i
niewystarczającą ilością badań nad zdrowiem intymnym kobiet, które od lat były zaniedbywane w badaniach
przedklinicznych. Pomyślna realizacja przedłożonego projektu rzuci nowe światło na strategie terapeutyczne
ukierunkowane na profilaktykę i wspieranie zdrowia pochwy.

Description: Prader-Willi syndrome (PWS) is a genetic disorder first described in 1956 by three Swiss
physicians: Prader, Labhart, and Willi. The cause of PWS is a disruption in the expression of certain
paternal genes located on chromosome 15, specifically in the 15q11.2-13 region, most commonly in the
form of deletion of the paternal copy or maternal uniparental disomy [1]. Infants suffering from PWS
exhibit delayed development, hypotonia, and lack of appetite [2],[3]. In later stages of life, a disrupted
sense of satiety (hyperphagia) and other symptoms related to hypothalamic dysfunction, such as
intellectual disability, thermoregulation disorders, and increased pain threshold, emerge [2],[3].
Importantly, patients with PWS show several symptoms in the oral cavity, including hypoplastic enamel,
dental caries, and periodontal disease [2]–[4]. One possible cause may be reduced secretion of abnormal
saliva, which is dense, sticky, viscous, and more acidic [2]–[4]. Consequently, important protective and
antibacterial functions of saliva are lost or significantly impaired. These saliva-related alterations,
combined with poor oral hygiene and increased consumption of carbohydrate-rich foods, predispose
PWS patients to various oral diseases [2],[3].
One of the key components of saliva crucial for oral health are proteins like mucins, lysozyme,
peroxidases, lactoferrin, and defensins, which perform protective and antimicrobial functions. Several
studies have compared the total protein concentration in the saliva of PWS patients and healthy
individuals, revealing higher protein levels in PWS patients [4],[5]. Targeted analyses using methods
like blotting and ELISA have also compared the levels of specific proteins related to oral health, such
as MUC7 mucin and cystatins, as well as the glucose-homeostasis-related protein irisin, in unstimulated
saliva [4],[6]. However, comprehensive studies on the protein composition of saliva in PWS patients are
still lacking.
Objective: The aim of this proposal is to compare the proteome of stimulated saliva of PWS patients
and healthy individuals using a high-throughput method, specifically high-performance liquid
chromatography coupled with mass spectrometry (LC-MS/MS), employing a bottom-up approach. The
choice of stimulated saliva is due to its larger obtainable volume compared to unstimulated saliva, which
is particularly important for PWS patients who produce small volumes of viscous saliva.