Narodowe Centrum Nauki

Hipoteza badawcza projektu zakłada, iż produkcja dwóch kluczowych mediatorów w układzie trójdzielnym - peptydu pochodnego genu kalcytoninowego (CGRP) oraz czynnika neurotroficznego pocłiodzenia mózgowego (BDNF) jest uzależniona od aktywności neuronów oraz obecności czynników zapalnych. Celem projektu jest zbadanie roli cytokiny prozapalnej - czynnika martwicy nowotworów (TNF) w modulacji funkcji neuronów czuciowych zwoju trójdzielnego.

Receptor γc (CD132) jest podjednostką wchodzącą w skład receptorów dla interleukin (IL) 2, 4, 7, 9, 15 i 21. Zbyt wysoka aktywacja γc prowadzi do nadmiernej odpowiedzi immunologicznej i może powodować rozwój chorób o podłożu autoimmunologicznym. Przyłączenie ligandu do receptora γc prowadzi do fosforylacji kinaz Janusowych JAK1 i JAK3, a następnie do przekazania sygnału do jądra komórkowego i aktywacji ekspresji genów. W ostatnich latach prowadzone są badania nad możliwością zastosowania inhibitorów kinaz JAK1 i JAK3 w terapii chorób o podłożu autoimmunologicznym. Celem badań zaplanowanych w ramach niniejszego projektu jest zbadanie, czy cefazolina, antybiotyk cefalosporynowy, hamuje aktywację receptora γc.

Celem niniejszego badania jest identyfikacja białkowych markerów prognostycznych dla płaskonabłonkowego raka sromu (RS). Komputerowa analiza zmian na poziomie szlaków regulatorowych mająca na celu modelowanie karcynogenezy może dostarczyć nowe mocne hipotezy dotyczące biologicznych przyczyn progresji RS. Zamierzamy opracować metodę ilościowej oceny ekspresji wybranego panelu białek z zastosowaniem techniki MRM (monitorowanie reakcji fragmentacji, ang. multiple reaction monitoring). Opracowany test umożliwi ilościową ocenę ekspresji badanych białek. Korelacja poziomu peptydów w guzach z danymi klinicznymi uzyskanymi z okresu obserwacji chorych pozwoli na ocenę wartości predykcyjnej testu. Metodyka badawcza zaproponowana w niniejszym wniosku może doprowadzić do detekcji wielu białek o odmiennej ekspresji w guzach uzyskanych od chorych z progresją RS („progVC”) w trakcie okresu obserwacji w porównaniu z ekspresją w guzach chorych z długim czasem przeżycia bez choroby (“d-fVC”) w czasie 8-12-letniej obserwacji. Białka te mogą być następnie pogrupowane według wspólnych cech biologicznych, co pozwoli odkryć zmiany będące przyczyną agresywnego fenotypu nowotworu.

Projekt realizowany w ramach konsorcjum naukowego Liderem projektu jest Instytut Genetyki Człowieka Polskiej Akademii Nauk natomiast Partnerami Instytut Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego Polskiej Akademii Nauk oraz Warszawski Uniwersytet Medyczny, I Wydział Lekarski.
W proponowanym projekcie zakładamy, że w nowotworach poza dobrze już udokumentowanymi uszkodzeniami genów, dochodzi również do niepoznanych jeszcze mutacji w obrębie regulomu (sekwencji niekodujących odpowiedzialnych za regulację ekspresji genów), które w znacznym stopniu przyczyniają się do patogenezy tych chorób.
Celem niniejszego projektu jest identyfikacja potencjalnych mutacji w obrębie regulomu płaskonabłonkowych raków krtani {ang. laryngeal squamous cell carcinoma - LSCC).
W niniejszym projekcie planujemy celowane sekwencjonowanie NGS regulomu, w skład którego wchodzi zdefiniowany region wielkości 46 min par zasad, pokrywający proksymalne enhancery i promotory, zidentyfikowane doświadczalnie metodami DNase l-seq i CAGE w ramach projektów ENCODE i FANTOM; zarówno konstytutywne (aktywny w wielu typach komórek) jak i specyficzne dla komórek epitelialnych. Sekwencjonowanie zostanie wykonane na platformie genomowej HiSeq 1500 (lllumina) z wykorzystaniem zestawu TruSeq SBS Kit (lllumina). Wszystkie biblioteki będą sekwencjonowanie w trybie sparowanych końców (2 x 100 pz) ze średnim pokryciem na poziomie 90x (minimalnie 20x) dla próbek referencyjnych oraz 190x (minimalnie 40x) dla nowotworowych linii komórkowych i guzów.
Materiał badany, w sumie 94 próbek, stanowić będzie 7 par: linia komórkowa LSCC - przynależna hodowla nienowotworowych fibroblastów oraz 40 par: ptaskonabłonkowy guz krtani - krew obwodowa (od tego samego pacjenta).
Równolegle zostanie przeprowadzona całogenomowa analiza ekspresji genów przy użyciu mikromacierzy w grupie 7 badanych linii komórkowych (w sumie trzykrotne powtórzenia) oraz w grupie 15 nienowotworowych próbek referencyjnych (komórki epitelialne),
Otrzymane wyniki zostaną poddane analizie bioinformatycznej, której celem będzie identyfikacja zmian somatycznych poprzez porównanie łinia komórkowa - fibroblasty, nowotwór - krew a następnie zintegrowanie zidentyfikowanych zmian z danymi ekspresyjnymi. Takie podejście pozwoli na wyłonienie mutacji w obszarach regulatorowych w sąsiedztwie genów o istotnie zmienionej ekspresji. W tym celu wykorzystana zostanie stale aktualizowaną baza danych obszarów i motywów regulatorowych (Nencki Genomics Database - NGD). Tym samym wybór najistotniejszych zmian w sekwencjach regulatorowych zostanie przeprowadzony na podstawie:
(a) wpływu znalezionych zmian na ekspresję sąsiadujących genów (porównanie ekspresji w grupach linie komórkowe - kontrolne tkanki nienowotworowe, dane mikromacierzowe),
(b) częstości występowania zmian w danej sekwencji regulatorowej (w grupie 40 nowotworów).
W ostatnim etapie prac najistotniejsze, zidentyfikowane zmiany zostaną zwalidowane innymi technikami (pirosekwencjonowanie, sekwencjonowanie Sangera, qRT-PCR) w grupie badanych linii komórkowych oraz guzów pierwotnych a także techniką Western biot na poziomie białka. Ponadto, w celu oszacowania częstości zmian zostanie przeprowadzone celowane badanie zidentyfikowanych loci powyższymi technikami w dodatkowej grupie 50 pierwotnych guzów krtani.
W literaturze na dzień dzisiejszy brak jest doniesień na temat udziału zmian w obrębie regulomu w patogenezie LSCC. Stąd planowane badania są pierwszym na skalę światową podejściem badawczym integrującym dane dotyczące obecności wariantów sekwencji regulatorowych z globalną ekspresją genów w tych nowotworach. Uważamy, że takie podejście badawcze może przyczynić się do opisania istotnych zmian w regulomie co przyczyni się do lepszego zrozumienia podstaw genetycznych patogenezy LSCC.

Projekt realizowany w ramach konsorcjum naukowego Liderem projektu jest Instytut Medycyny Doświadczalnej i Klinicznej im. Mirosława Mossakowskiego Polskiej Akademii Nauk natomiast Partnerem Warszawski Uniwersytet Medyczny, I Wydział Lekarski.
Zespół Gillesa de la Tourette'a (GTS) jest schorzeniem neuropsychiatrycznym dzieci i dorosłych o nieznanej przyczynie, którego głównymi objawami są tiki i zaburzenia psychiczne. Nasilenie tików zmniejsza się po 15 rż. Jedynie u 1/5 osób tiki utrzymują się w stopniu ciężkim w wieku dorosłym. Przyczyna ustępowania tików u niektórych tylko osób jest nieznana. Nie istnieje obecnie test diagnostyczny potwierdzający kliniczną diagnozę GTS. W patogenezie choroby główną rolę odgrywają czynniki genetyczne.. Autyzm jest wczesnodziecięcym zaburzeniem rozwojowym, które powoduje zaburzenia funkcjonowania społecznego, zaburzenia mowy i stereotypie ruchowe. U części chorych z GTS występują cechy autystyczne a oba schorzenia wykazują objawy wspólne. Podłoże biologiczne autyzmu nie jest ustalone. Celem badania jest określenie podłoża genetycznego choroby w wyselekcjonowanych trzech grupach: 1. w rodzinach z GTS o bardzo wyraźnym wywiadzie rodzinnym choroby; 2. w rodzinach, w których GTS i autyzm występuje u blisko spokrewnionych osób; oraz 3. w grupie osób dorosłych z GTS i ciężkim tikami (co może wskazywać na obecność dodatkowego czynnika genetycznego). W badaniach planujemy wykorzystać nie stosowaną dotychczas w badaniu podłoża GTS metodę analizy sekwencji całego genomu (whole genome sequencing, WGS), dzięki czemu w uzyskanych surowych wynikach sekwencjonowania możliwe będzie wyszukiwanie zmienności liczby kopii DNA (copy number variants, CNV), regionów utraty heterozygotyczności (loss of heterozygosity, LOH), rzadkich wariantów genetycznych (mutacji) oraz zidentyfikowanie mutacji sprawczych poprzez zastosowanie najnowszych algorytmów bioinformatycznych, porównywanie sekwencji genomów zdrowych i chorych członków rodziny oraz pacjentów z różnymi fenotypami klinicznymi GTS (m.in. postać ciężka GTS dorosłych vs postać łagodna dziecięca).
W badaniach zostaną wykorzystane trzy grupy: 1. osiem rodzin, z których w każdej występuje co najmniej 5 osób z rozpoznaniem GTS lub innymi tikami (badaniu poddanych zostanie 40 osób z każdej z rodzin: 3 osoby chore + 2 osoby zdrowe, najczęściej rodzice); 2. cztery rodziny z współwystępowaniem GTS oraz autyzmu (badaniu poddanych zostanie 20 osób: 4 osoby z GTS, 4 osoby z autyzmem oraz 12 zdrowych członków rodziny); oraz 3. grupa dorosłych pacjentów z GTS i ciężkim tikami (30 osób). Całkowita grupa badana obejmowała będzie 90 osób. Ponieważ populacja dzieci z GTS w Polsce sięga 60.000 osób, a dorosłych ok. 3.500 osób, liczebności grup badanych są reprezentatywne i dają szansę na określenie podłoża genetycznego choroby, zwłaszcza że grupy 1. i 2. dotyczą postaci rodzinnych, a grupa 3. ciężkiej postaci GTS. W badaniach planujemy wykorzystać nie stosowaną dotychczas w badaniach nad GTS metodę sekwencjonowania całego genomu (WGS). W uzyskanych surowych odczytach genomu wyszukiwane będą zarówno warianty ilości kopii (CNV), jak i zmiany punktowe sekwencji DNA. Otrzymana lista wariantów poddana będzie dalszej, dogłębnej analizie bioinformatycznej z zastosowaniem najnowszych algorytmów i dostępnych narzędzi. Analiza będzie miała na celu zidentyfikowanie wariantów potencjalnie sprawczych, zwłaszcza tych, które mogą wpływać na strukturę produktów białkowych.
Analiza bioinformatyczna każdorazowo obejmowała będzie porównanie genomów osób chorych i zdrowych w obrębie rodziny, osób chorych pomiędzy rodzinami oraz osób chorych z sekwencjami zgromadzonymi w publicznych bazach danych. W analizie zostanie dodatkowo wykorzystana przygotowana przez nas w ramach realizacji innego projektu baza sekwencji całego eksomu >100 osób z populacji polskiej.
Wyselekcjonowane warianty genomowe zostaną potwierdzone metodą sekwencjonowania sangerowskiego lub MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification), a ich występowanie sprawdzone będzie jak najszerzej w rodzinach probandów.
Projekt jest pierwszą w Polsce próbą poznania genetycznego podłoża GTS oraz ustalenia możliwych zależności pomiędzy genotypem a fenotypem klinicznym choroby. Unikalność badania polega na wykorzystaniu nowoczesnej metody sekwencjonowania całego genomu (WGS) i zaawansowanych metod bioinformatycznych z wykorzystaniem danych uzyskanych z jednorodnych pod względem pochodzenia etnicznego i w pełni klinicznie opisanych grupach pacjentów i osób zdrowych. W jednym badaniu analizowane będą zarówno szeroko pojęte rearanżacje genomu, jak zmiany punktowe sekwencji DNA, a zwłaszcza mutacje sprawcze. Spodziewamy się, że realizacja projektu doprowadzi do zidentyfikowania nowych genów i/lub loci związanych z GTS, określenia wspólnych genów/loci dla chorób neuropsychiatrycznych takich jak autyzm i GTS, ustalenie podłoża genetycznego warunkującego zmienny przebieg GTS, wskazania szlaków biochemicznych i/lub sygnałowych na poziomie komórkowym, a także umożliwi wyznaczenie markerów genomowych choroby a w przyszłości opracowania nowych metod leczenia GTS.

Gruczolaki przysadki (pituitary adenomas) są guzami powstającymi z przedniego płata przysadki, która pełni funkcję centralnego regulatora hormonalnej homeostazy w organizmie. Guzy przysadki stanowią 10-15% wszystkich nowotworów wewnątrzczaszkowych, spośród których zdecydowana większość to gruczolaki. Zazwyczaj są zmianami łagodnymi, ale mogą zdarzać się również formy złośliwe, ze złą prognozą, w których wczesna detekcja nowotworu i wdrożenie leczenia neurochirurgicznego znacząco poprawia rokowanie. Do chwili obecnej, nie ma dobrego biomarkera dla złośliwych gruczolaków przysadki [1,2,6].
MicroRNA są małymi, niekodującymi cząsteczkami RNA, które mogą wpływać na regulację genów. W literaturze potwierdzono zmiany ekspresji microRNA w różnych typach nowotworów [4,5]. Najnowsze badania sugerują, deregulację microRNA również w patogenezie gruczolaków przysadki [3].
Obecny projekt zakłada identyfikację nowych cząsteczek microRNA, które mogłyby w przyszłości posłużyć jako nowy marker inwazyjności gruczolaków przysadki, przy użyciu Sekwencjonowania Nowej Generacji (NGS, Next Generation Sequencing). Kolejnym celem niniejszego projektu jest zbadanie regulacyjnej roli wybranych microRNA mających miejsce wiązania w odcinkach 3’ UTR genów dla białek cyklu komórkowego. Do dziś, niewiele wiadomo na temat regulacyjnej roli wybranych w projekcie microRNA oraz ich wpływu na poziom ekspresji białek cyklu komórkowego w gruczolakach przysadki. Warto zaznaczyć, że zwiększona ekspresja cyklin będące przedmiotem badań niniejszego projektu, często korelowana jest ze zwiększoną złośliwością nowotworów, inwazyjnością i tworzeniem przerzutów w wielu nowotworach[7].
Podsumowując, powyższy projekt zakłada zbadanie wpływu epigenetycznych czynników na ekspresję
białek cyklu komórkowego oraz potencjał inwazyjności in vitro w modelowych liniach komórkowych gruczolaków przysadki. Jednocześnie, celem przeprowadzonych badań jest znalezienie nowych genów microRNA, których zmianę ekspresji udało się potwierdzić we wstępnie przeprowadzonych badaniach.
Wyniki eksperymentów zawartych w projekcie będą miały dużą wartość poznawczą, gdyż mogą pomóc w rozumieniu wciąż niewyjaśniony wpływu microRNA na ekspresję białek cyklu komórkowego w ludzkich gruczolakach przysadki. Dodatkowo, realizacja niniejszych badań może pomóc w odkryciu zupełnie nowych zaburzeń komórkowych prowadzących do zahamowania lub progresji komórek nowotworowych, a w konsekwencji wyznaczyć kierunek poszukiwań nowych celów terapeutycznym w leczeniu ludzkich gruczolaków przysadki.

Wyniki wysokoprzepustowego sekwencjonowania DNA uzyskane od pacjentów z dziedzicznymi chorobami siatkówki ujawniły ogromną liczbę wariantów genetycznych o nieznanym znaczeniu klinicznym. Pilna potrzeba dalszych badań molekularnych mających na celu weryfikację patogenności tych wariantów, krzyżuje się z brakiem dostępu do siatkówki, części oka bezpośrednio dotkniętej chorobą. W związku z nowymi odkryciami wskazującymi na ekspresję genów ludzkiej siatkówki również w skórze, uważamy, że komórki skóry mogą stanowić dobry model do badania przetwarzania zmutowanych genów odpowiedzialnych za rozwój dystrofii siatkówki. W niniejszej pracy zamierzamy swą uwagę skupić na genie ABCA4, który jest jednym z głównych genów siatkówki i odpowiada za patomechanizm wielu jej chorób dziedzicznych. Naszym głównym celem jest określenie składu transkryptów ABCA4 i zbadanie ekspresji tego genu na poziomie mRNA i białka w mieszkach włosowych, keratynocytach i fibroblastach. Na potrzeby realizacji tego zadania z pobranych biopsji skóry zostaną założone pierwotne hodowle keratynocytów i fibroblastów. Naszym kolejnym celem będzie porównanie danych eksperymentalnych, aby wybrać i wdrożyć najbardziej odpowiedni typ komórek do badania metabolizmu zmutowanego genu ABCA4 u pacjentów.
W celu realizacji przedstawionych celów zostanie przeprowadzona analiza jakościowa transkryptów z zastosowaniem techniki szybkiej amplifikacji końców cDNA (RACE) oraz sekwencjonowania cDNA. Ilościowa ekspresja genu ABCA4 na poziomie mRNA i białka zostanie zmierzona z użyciem odpowiednio metody PCR w czasie rzeczywistym oraz metody Western Blot.
Spodziewanym efektem niniejszej pracy będzie analiza wpływu mutacji ABCA4 na proces jego przetwarzania i weryfikacja patogenności tych zmian w środowisku wewnątrzkomórkowym. Ponadto po raz pierwszy zostaną zidentyfikowane sekwencje transkryptów ABCA4 w różnych typach komórek skóry. Jesteśmy przekonani, że model zaproponowany w tych badaniach zostanie z powodzeniem wdrożony do analizy mutacji także innych genów siatkówki zaangażowanych w rozwój szerokiego spektrum dystrofii tylnej części oka i może stanowić punkt wyjścia do dalszych badań mających na celu odkrycie roli ABCA4 w skórze.

Według Światowej Organizacji Zdrowia (WHO), nowotwory złośliwe są najczęstszą przyczyną śmierci na całym świecie, powodując około 8,2 mln zgonów rocznie. Każdego roku diagnozuje się około 14 milionów nowych przypadków nowotworów złośliwych. Według najnowszych sprawozdań Międzynarodowej Agencji Badań nad Rakiem (IARC) oczekuje się, że roczna liczba przypadków nowotworów złośliwych wzrośnie z 14 milionów w 2012 roku do 22 milionów w ciągu dwóch następnych dziesięcioleci.
W Polsce nowotwory złośliwe są drugą pod względem częstości przyczyną śmierci, po chorobach układu krążenia. Podczas gdy śmiertelność z powodu chorób układu krążenia spadła znacznie w ostatnich latach, śmiertelność w wyniku nowotworów znacząco wzrosła. Rzeczywiście, umieralność z powodu nowotworów w 2008 była w Polsce wyższa niż w roku 1980, stanowiąc 25,8% wszystkich zgonów, natomiast śmiertelność z powodu chorób układu krążenia w 2008 roku była niższa o około 39% porównaniu z rokiem 1980. Istotnym faktem jest to, że zarówno zachorowalność, jak i śmiertelność z powodu nowotworów w Polsce plasują się na jednym z najwyższych poziomów wśród wszystkich krajów UE. Według najnowszego raportu z Krajowego Rejestru Nowotworów, w roku 2012 stwierdzono ponad 152 000 nowo zdiagnozowanych osób z nowotworami złośliwymi i ponad 94 000 zgonów związanych z tymi chorobami. Klasyczne formy terapii takie jak chirurgia, chemioterapia i radioterapia, są w obecnej chwili tylko częściowo skuteczne w walce z nowotworami. Pomimo licznych osiągnięć w dziedzinie genetyki i biologii molekularnej, wirusologii, chemii oraz farmakologii, nowotwory nadal skutecznie unikają leczenia. Jednakże dzięki rosnącej innowacyjności, odkryciom naukowym i postępowi technologicznemu, rozumienie choroby nowotworowej ulega głębokiej przemianie. Chociaż jeszcze w początkowym stadium, tak zwana medycyna spersonalizowana staje się nowym paradygmatem w leczeniu nowotworów. Częścią tego nowego paradygmatu jest zrozumienie nowotworu jako choroby układowej, w której zachodzi intensywny dialog między nowotworem a gospodarzem, a zwłaszcza układem odpornościowym gospodarza. Należy zwrócić uwagę, że w świetle obecnego stanu wiedzy, zdolność swoistego rozpoznawania cząsteczek związanych z nowotworem przez układ odpornościowy człowieka, czyni go narzędziem niezwykle precyzyjnym i wysoce odpowiednim dla personalizacji zabiegów przeciwnowotworowych. Dotyczy to w szczególności nowotworów związanych z zakażeniami przez takie wirusy jak HCV, HBV lub HPV, które według WHO są odpowiedzialne za prawie 20% zgonów w wyniku nowotworów w krajach o niskim i średnim dochodzie. Science Magazine nazwał immunoterapię raka "Przełomem roku 2013". Rzeczywiście, immunoonkologia jest obecnie jednym z najbardziej energicznie rozwijających się obszarów badań nad chorobami nowotworowymi i budzi wielkie nadzieje na znalezienie lekarstwa na te wyniszczające choroby. Przewiduje się, że w następnej dekadzie, immunoterapie będą podstawą leczenia w 60% typów nowotworów. Zanim jednak układ odpornościowy może zostać w pełni skutecznie wykorzystany w walce z rakiem, należy poradzić sobie z kilkoma wyzwaniami. Wyzwania te można podzielić na dwa główne obszary: 1. zrozumienie mechanizmów ucieczki nowotworu przed układem odpornościowym; 2. identyfikacja najbardziej skutecznych narzędzi przeciwnowotworowych wywodzących się z układu odpornościowego.
Wiele dowodów wskazuje na to, że nowotwory wykorzystują co najmniej kilka różnych mechanizmów, aby uniknąć kontrolowania przez układ odpornościowy. Jeden z tych mechanizmów opiera się na wzroście warunków stresu oksydacyjnego oraz wysokim poziomie reaktywnych form tlenu (ROS), takich jak nadtlenek wodoru, w obrębie masy guza. Kolejnym istotnym elementem są warunki obniżonej dostępności tlenu panujące w środowisku nowotworu zwane hipoksją. W takich warunkach następuje wyłączanie licznych mechanizmów przeciwnowotworowych w komórkach układu odpornościowego. Dlatego też ważnym staje się zrozumienie, jak komórki układu odpornościowego mogą dostosować się do tak wrogiego środowiska. Jest to jeden z celów niniejszego wniosku.
Komórki naturalni zabójcy (NK) są częścią ludzkiego układu odpornościowego i działają na pograniczu pomiędzy odpornością wrodzoną a nabytą. Liczne publikacje sugerują, że prawidłowe funkcjonowanie komórek NK odgrywa ważną rolę w walce przeciw zakażeniom wirusowym i nowotworom. W związku z tym, obecnie prowadzone są intensywne badania, aby te komórki z powodzeniem wykorzystać jako narzędzie terapeutyczne w walce z nowotworami. Niestety, przeciwnowotworowa aktywność komórek NK może być tłumiona przez wysoki poziom stresu oksydacyjnego lub hipoksyjne środowisko guza, co z kolei może poważnie utrudniać ich zastosowanie w onkologii. Z tego powodu, w naszym projekcie staramy się zrozumieć szczegółowo mechanizmy, które zachodzą w komórkach NK w warunkach stresu oksydacyjnego i hipoksji. Na tej podstawie chcemy wytypować mechanizmy, które mogą potencjalnie chronić komórki NK przed hamującym wpływem stresu oksydacyjnego i hipoksji. W finalnym etapie projektu zamierzamy stworzyć komórki NK, które będą w stanie przezwyciężyć wpływ hamującego środowiska nowotworu i skutecznie zabijać komórki nowotworowe.
W niniejszym projekcie wykorzystamy nowoczesną technikę sekwencjonowania RNA, w celu wychwycenia zmian zachodzących w komórkach NK poddanych działaniu stresu oksydacyjnego i hipoksji. Przeprowadzone badania dostarczą nam szerokiej gamy informacji na temat zmian ekspresji genów w komórkach NK w warunkach, które towarzyszą nowotworom. Spośród tej gamy dostępnych informacji wybierzemy te, które będą miały znaczenie dla zwalczania komórek nowotworowych przez komórki NK. W oparciu o zdobytą wiedzę zmodyfikujemy komórki NK, w taki sposób, żeby mogły skutecznie rozpoznawać i zabijać komórki nowotworowe w nieprzyjaznych warunkach stresu oksydacyjnego i hipoksji.
Decydując się na tak ambitny projekt chcemy przyczynić się do zidentyfikowania i zrozumienia molekularnych mechanizmów regulujących aktywność komórek NK w środowisku nowotworu, a następnie zdobytą wiedzę wykorzystać do stworzenia komórek NK, odpornych na hamujące działanie nowotworów. Zdobywa przez nas wiedza może w przyszłości doprowadzić do ulepszenia metod leczniczych, wykorzystujących modyfikowane komórki NK jako terapię przeciw nowotworom. Terapia ta może znaleźć zastosowanie także w innych chorobach człowieka.

Hipoteza: Coraz więcej danych wskazuje, że zaburzenie równowagi redoks selektywnie niszczy komórki nowotworowe, a niektóre enzymy antyoksydacyjne są ważnymi celami terapeutycznymi. Tioredoksyny (TXN), oraz należące do tej samej rodziny białek peroksyredoksyny (PRDX), są enzymami antyoksydacyjnymi, zapewniającymi utrzymanie równowagi redoks. Nasze badania wstępne wykazały znacznie podwyższony poziom reaktywnych form tlenu w komórkach ostrej białaczki limfoblastycznej B komórkowej (B-ALL). Ponadto, zarówno w liniach komórkowych B-ALL, jak i w limfoblastach pacjentów, zaobserwowaliśmy podwyższony poziom ekspresji enzymów antyoksydacyjnych z rodziny TXN. Poziom ekspresji tych enzymów wzrastał u pacjentów na etapie wznowy. Co więcej, w liniach B-ALL zaobserwowaliśmy, że PRDX1 wspomaga proliferację komórek białaczkowych. Przypuszczamy, że enzymy z rodziny TXN są jednym z czynników poprawiających przeżycie komórek białaczkowych w warunkach stresu oksydacyjnego i mogą być nowymi celami terapeutycznymi.
Cel badań: W niniejszym projekcie zbadamy skuteczność nowej, pro-oksydacyjnej strategii w leczeniu B-ALL. Najważniejszym celem projektu jest walidacja PRDX1 i innych enzymów z rodziny TXN jako potencjalnych, nowych celów terapeutycznych w B-ALL. Planujemy również zbadać, w jaki sposób PRDX1 wspomaga proliferację i przeżycie komórek B-ALL. Ponadto, chcielibyśmy ocenić, czy inhibitory enzymów z rodziny TXN uwrażliwiają komórki B-ALL na chemioterapeutyki stosowane w leczeniu B-ALL.
Metoda badawcza: Aby osiągnąć powyższe cele, planujemy zastosować kilka modeli badawczych: linie komórkowe B-ALL (NAM-6 i SEMK2), materiał kliniczny pobrany od pacjentów B-ALL (limfoblasty izolowane ze szpiku, surowicę), oraz mysi model in vivo. Realizowane będą 3 zadania badawcze:
Zadanie 1. Walidacja PRDX1 oraz innych enzymów antyoksydacyjnych z rodziny TXN jako celów terapeutycznych w B-ALL w modelach linii komórkowych.
1A. Zbadanie efektów zahamowania ekspresji PRDX1 na przeżycie i proliferację komórek B-ALL.
1B. Zbadanie czy zahamowanie proliferacji komórek białaczkowych wynikające z zablokowania ekspresji PRDX1 zależy od cystein.
1C. Zbadanie odpowiedzi transkrypcyjnej komórek białaczkowych na zahamowanie ekspresji PRDX1 za pomocą wysokoprzepustowych metod genetycznych.
1D. Badanie skuteczności terapii łączących inhibitory enzymów antyoksydacyjnych z rodziny TXN z chemioterapeutykami stosowanymi w leczeniu B-ALL.
Zadanie 2. Zbadanie biomarkerów stresu oksydacyjnego oraz ekspresji enzymów antyoksydacyjnych z rodziny TXN w materiale pobranym od pacjentów z B-ALL.
2 A. Zgromadzenie materiału od pacjentów i bazy klinicznej dorosłych i dzieci z rozpoznanym B-ALL
2 B. Ocena biomarkerów stresu oksydacyjnego w surowicy pobranej od pacjentów B-ALL
2 C. Ocena poziomu ekspresji enzymów z rodziny TXN u pacjentów B-ALL
2 D. Analiza statystyczna parametrów redoks w odniesieniu do danych klinicznych
Zadanie 3. Zbadanie skutków zablokowania enzymów antyoksydacyjnych z rodziny TXN in vivo w mysim modelu ludzkiej białaczki.
Wpływ rezultatów: B-ALL jest najczęstszym nowotworem pediatrycznym. W leczeniu B-ALL stosuje się prawie wyłącznie klasyczną chemioterapię. Większość chorych dobrze odpowiada na leczenie indukujące remisję, jednak u około 20% pacjentów dochodzi do wznowy, często opornej na leczenie. Lepsze poznanie biologii B-ALL oraz mechanizmów molekularnych odpowiedzialnych za proliferację i przeżycie limfoblastów, w szczególności roli enzymów antyoksydacyjnych z rodziny TXN, przyczyni się do poprawy skuteczności istniejących metod leczenia i może wskazać nowe cele w terapii B-ALL.
PRDX1, jako enzym metabolizujący nadtlenki, pełni ważne funkcje sygnalizacyjne. Dodatkowo, w warunkach stresu oksydacyjnego, PRDX1 może pełnić funkcję białka opiekuńczego. Nie wszystkie funkcje PRDX1 zależą od aktywności związanej z usuwaniem nadtlenków. Jak dotąd nie jest jasne, czy anty-apoptotyczna funkcja PRDX1 zależy od cystein i aktywności związanej z metabolizmem nadtlenków. W niniejszym projekcie spróbujemy odpowiedzieć na to pytanie. Lepsze poznanie działania anty-apoptotycznego PRDX1 przyczyni się do powstania nowych, bardziej selektywnych inhibitorów tego enzymu.