Całogenomowe poszukiwanie mutacji regulomu w płaskonabłonkowym raku krtani.

Projekt realizowany w ramach konsorcjum naukowego Liderem projektu jest Instytut Genetyki Człowieka Polskiej Akademii Nauk natomiast Partnerami Instytut Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego Polskiej Akademii Nauk oraz Warszawski Uniwersytet Medyczny, I Wydział Lekarski.
W proponowanym projekcie zakładamy, że w nowotworach poza dobrze już udokumentowanymi uszkodzeniami genów, dochodzi również do niepoznanych jeszcze mutacji w obrębie regulomu (sekwencji niekodujących odpowiedzialnych za regulację ekspresji genów), które w znacznym stopniu przyczyniają się do patogenezy tych chorób.
Celem niniejszego projektu jest identyfikacja potencjalnych mutacji w obrębie regulomu płaskonabłonkowych raków krtani {ang. laryngeal squamous cell carcinoma - LSCC).
W niniejszym projekcie planujemy celowane sekwencjonowanie NGS regulomu, w skład którego wchodzi zdefiniowany region wielkości 46 min par zasad, pokrywający proksymalne enhancery i promotory, zidentyfikowane doświadczalnie metodami DNase l-seq i CAGE w ramach projektów ENCODE i FANTOM; zarówno konstytutywne (aktywny w wielu typach komórek) jak i specyficzne dla komórek epitelialnych. Sekwencjonowanie zostanie wykonane na platformie genomowej HiSeq 1500 (lllumina) z wykorzystaniem zestawu TruSeq SBS Kit (lllumina). Wszystkie biblioteki będą sekwencjonowanie w trybie sparowanych końców (2 x 100 pz) ze średnim pokryciem na poziomie 90x (minimalnie 20x) dla próbek referencyjnych oraz 190x (minimalnie 40x) dla nowotworowych linii komórkowych i guzów.
Materiał badany, w sumie 94 próbek, stanowić będzie 7 par: linia komórkowa LSCC - przynależna hodowla nienowotworowych fibroblastów oraz 40 par: ptaskonabłonkowy guz krtani - krew obwodowa (od tego samego pacjenta).
Równolegle zostanie przeprowadzona całogenomowa analiza ekspresji genów przy użyciu mikromacierzy w grupie 7 badanych linii komórkowych (w sumie trzykrotne powtórzenia) oraz w grupie 15 nienowotworowych próbek referencyjnych (komórki epitelialne),
Otrzymane wyniki zostaną poddane analizie bioinformatycznej, której celem będzie identyfikacja zmian somatycznych poprzez porównanie łinia komórkowa - fibroblasty, nowotwór - krew a następnie zintegrowanie zidentyfikowanych zmian z danymi ekspresyjnymi. Takie podejście pozwoli na wyłonienie mutacji w obszarach regulatorowych w sąsiedztwie genów o istotnie zmienionej ekspresji. W tym celu wykorzystana zostanie stale aktualizowaną baza danych obszarów i motywów regulatorowych (Nencki Genomics Database - NGD). Tym samym wybór najistotniejszych zmian w sekwencjach regulatorowych zostanie przeprowadzony na podstawie:
(a) wpływu znalezionych zmian na ekspresję sąsiadujących genów (porównanie ekspresji w grupach linie komórkowe - kontrolne tkanki nienowotworowe, dane mikromacierzowe),
(b) częstości występowania zmian w danej sekwencji regulatorowej (w grupie 40 nowotworów).
W ostatnim etapie prac najistotniejsze, zidentyfikowane zmiany zostaną zwalidowane innymi technikami (pirosekwencjonowanie, sekwencjonowanie Sangera, qRT-PCR) w grupie badanych linii komórkowych oraz guzów pierwotnych a także techniką Western biot na poziomie białka. Ponadto, w celu oszacowania częstości zmian zostanie przeprowadzone celowane badanie zidentyfikowanych loci powyższymi technikami w dodatkowej grupie 50 pierwotnych guzów krtani.
W literaturze na dzień dzisiejszy brak jest doniesień na temat udziału zmian w obrębie regulomu w patogenezie LSCC. Stąd planowane badania są pierwszym na skalę światową podejściem badawczym integrującym dane dotyczące obecności wariantów sekwencji regulatorowych z globalną ekspresją genów w tych nowotworach. Uważamy, że takie podejście badawcze może przyczynić się do opisania istotnych zmian w regulomie co przyczyni się do lepszego zrozumienia podstaw genetycznych patogenezy LSCC.