Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego

Celem projektu jest identyfikacja i stratyfikacja chłoniaków z dużych rozlanych komórek B (DLBCL, ang. Diffuse large D-cdl lymphoma) zależnych od sygnału z receptora limfocytów B (BCR, ang. B-cell receptor) o niskiej lub wysokiej aktywności czynnika transkrypcyjnego NF-KB. W ramach projektu planowane jest zbadanie aktywności przeciwnowotworowej wyselekcjonowanych inhibitorów sygnału z BCR w liniach komórkowych DLBCL oraz pierwotnych komórkach DLBCL uwzględniając ich podział na linie BCR-zależne i BCR-niezależne oraz o niskiej i wysokiej podstawowej aktywności czynnika transkrypcyjnego NF-KB. W dalszym etapie projektu planowane jest także opracowanie kompleksowego panelu przeciwciał do analizy statusu sygnału z BCR i odpowiedzi na terapię inhibitorami BCR w ustalonych oraz pierwotnych liniach komórek DLBCL metodą cytometrii masowej - CyTOF. Równolegle będzie prowadzona kompleksowa charakterystyka zmian genetycznych w szlaku przekazywania sygnału z BCR w modelu 317 pierwotnych linii komórek DLBCL o znanym statusie cell-of-origin (COO) oraz consensus cluster classification (CCC), poddanych sekwencjonowaniu egzomowemu.
DLBCL jest agresywnym chloniakiem o zróżnicowanym podłożu genetycznym, a co za tym idzie - o 'zróżnicowanym obrazie klinicznym. Projekt badań nad molekularnymi mechanizmami patogenezy DLBCL związanymi z przekazywaniem sygnału z BCR jest o tyle istotny, że inhibitory sygnału z BCR zostały już zarejestrowane do terapii przewlekłej białaczki limfocytowej (CLL, ang. chronic lymphocytic leukemia), ale nie DLBCL, pomimo, że obie te choroby zależne są od sygnału z BCR. W wypadku DLBCL identyczne morfologicznie komórki mogą być zależne od zupełnie różnych szlaków przekazywania sygnałów pro-życiowych, a zatem inaczej odpowiadać na chemiczne zahamowanie aktywności kinaz związanych z BCR. Dokładniejsze poznanie mechanizmów prowadzących do transformacji nowotworowej limfocytów B w przypadku DLBCL może przyczynić się do lepszego zrozumienia przeciwnowotworowego działania inhibitorów BCR.
Wpływ inhibitorów proksymalnych kinaz związanych z BCR na komórki DLBCL zależne od sygnału tego receptora nie był do tej pory systematycznie zbadany. Pomimo wielu doniesień wskazujących, że inhibitory BCR mają działanie przeciwnowotworowe, nie zostało jednoznacznie stwierdzone, jaki jest mechanizm ich działania oraz czy zachodzą interakcje między różnymi lekami z tej grupy. Wstępne wyniki wskazują, że aby osiągnąć bardziej skuteczne działanie przeciwnowotworowe w terapii DLBCL powinno się stosować kombinację różnych inhibitorów BCR. Taka strategia miałaby przede wszystkim zapobiec uruchomieniu pro-życiowych szlaków kompensacyjnych w komórkach nowotworowych. Zagadnienie to wymaga jednak szczegółowych badań, których przeprowadzenie zaplanowano w ramach niniejszego projektu. Pomimo znaczącego postępu, jaki w ostatnich latach dokonał się w genomice nowotworów i opublikowania licznych wyników sekwencjonowania genomów komórek wielu rodzajów nowotworów, dane genetyczne dotyczące pierwotnego klinicznego materiału pobranego od chorych na DLBCL wciąż są niewystarczające, aby z. wysokim prawdopodobieństwem zidentyfikować mutacje odgrywające wiodącą rolę w patogenezie tej choroby.
Spodziewanym rezultatem proponowanego projektu będzie:
a) Identyfikacja najbardziej korzystnych terapeutycznie kombinacji inhibitorów BCR w zależności od podłoża molekularnego DLBCL.
b) Opracowanie kompleksowego i wygodnego w użyciu panelu przeciwciał CyTOF do analizy podłoża molekularnego DLBCL oraz. odpowiedzi komórek na terapię inhibitorami BCR.
Analiza danych sekwencjonowania egzomowego zbioru 317 pierwotnych komórek DLBCL w celu poszukiwania nowych mutacji o potencjalnym znaczeniu prognostycznym i terapeutycznym w tej chorobie.

Flora jelitowa człowieka ma kluczowe znaczenie dla zdrowia głównie poprzez wpływ na układ immunologiczny oraz metabolizm substancji odżywczych i ksenobiotyków. Jedną z grup związków podlegających istotnym zmianom strukturalnym pod jej wpływem są elagotanoidy, będące wielkocząsteczkowymi polifenolami występującymi w orzechach włoskich, soku z granatu, malinach, truskawkach, czy dojrzewającym w beczkach winie. Pozytywne efekty spożywania tych produktów na układ krążenia oraz nieswoiste stany zapalne jelita grubego są szczególnie podkreślane, a ze względu na wykazany w ostatnich latach metabolizm elagotanoidów przez florę jęlitową, postuluje się, że za obserwowane działanie odpowiedzialne mogą być powstające w jelicie biodostępne urolityny.
Ponieważ istotną rolę w patofizjologii powyższych chorób odgrywają zaburzenia w funkcjonowaniu mechanizmów związanych z aktywnym wygaszaniem stanu zapalnego, celem projektu będzie zbadanie wpływu urolityn na molekularne procesy leżące u podstaw tego zjawiska.
Zostaną przeprowadzone porównawcze badania in vitro wpływu urolityn i ich metabolitów II fazy: glukuronidów oraz siarczanów (pozyskanych z moczu ochotników spożywających bogate w elagotanoidy produkty) na apoptozę neutrofili, fagocytozę neutrofili przez makrofagi (eferocytozę) oraz wydzielanie czynników przeciwzapalnych przez makrofagi. Dodatkowo zostanie zbadana hydroliza glukuronidów urolityn pod wpływem glukuronidazy uwalnianej przez stymulowane neutrofde i makrofagi.
Wykazanie wpływu urolityn na aktywne wygaszanie stanu zapalnego przyczyni się do potwierdzenia skuteczności terapeutycznej bogatych w elagotanoidy produktów w schorzeniach związanych z przewlekłym stanem zapalnym oraz pozwoli wskazać molekularne mechanizmy działania odpowiedzialny za te efekty.

W ramach umowy finansowane jest 6 stypendiów doktoranckich i dofinasowany jest koszt utrzymania infrastruktury badawczej w ramach I edycji programu Ministra Nauki i Szkolnictwa Wyższego pn. „Doktorat wdrożeniowy”.

Cel naukowy: Nadrzędnym celem projektu jest stworzenie modelu szczurzego zmodyfikowanych komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej produkujących białko TRAIL o działaniu przeciwnowotworowymi, podawanych do wolnych płatów tkankowych. Kolejnym celem jest opracowanie kompletnego modelu zwierzęcego brachyterapii biologicznej.
Stan wiedzy: Nowotwory występujące w powierzchownych warstwach ludzkiego ciała (skóra, pierś, okolica głowy i szyi) wymagają, po radykalnej resekcji, adekwatnej terapii odtwórczej. Do tej pory nie opracowano łatwego do wdrożenia i bezpiecznego modelu tworzenia funkcjonalnych płatów tkankowych, które poza przywróceniem wyglądu tkance oddziaływałyby na pierwotną przyczynę choroby. Istnieją nieliczne doniesienia na temat brachyterapii biologicznej – procesu tworzenia zmodyfikowanych płatów tkankowych, wywierających dodatkowy, lokalny efekt leczniczy na zamianę pierwotną np. przeciwnowotworowy, przyspieszający gojenie ran przewlekłych, angiogenezę. Do tej pory nie wykorzystywano komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej (ADSC) poddanych modyfikacji genetycznej do opracowania takich płatów tkankowych. Badanie ma charakter translacyjny, w przypadku udowodnienia skuteczności funkcjonalnych płatów tkankowych zebrane dane mogą posłużyć wdrożeniu analogicznego rozwiązania w rekonstrukcji piersi po mastektomii z powodu raka sutka.
Materiał i metody: Projekt składa się z kolejnych zadań, które wykonane sekwencyjnie pozwolą na opracowanie kompletnego szczurzego modelu brachyterapii biologicznej. W pierwszej kolejności zostanie zoptymalizowana procedura chirurgiczna – podniesienia płata skórno-podskórnego z naczyń nabrzusznych powierzchownych dolnych oraz perfuzji płata. Kolejno, z tkanki tłuszczowej szczura zostaną wyizolowane komórki ADSC, następnie poddane transdukcji lentiwirusowej-wektorami z białkiem fluorescencyjnym. Zmodyfikowane komórki posłużą optymalizacji perfuzji płatów tkankowych. Ponadto, ADSC zostaną poddane transdukcji lentiwirusami-wektorami z białkiem TRAIL. Efekt cytotoksyczny tak zmodyfikowanych komórek wobec komórek szczurzej linii raka sutka RBA zostanie zbadany in vitro. Następnie ADSC produkujące TRAIL zostaną podane do wolnego płata skórnego, pod którym zostanie wyindukowany guz raka sutka RBA. Skuteczność podania zmodyfikowanych komórek do płata zostanie potwierdzona: obserwacją przeżycia zwierząt, przyżyciową wizualizacją dynamiki wzrostu guza oraz mikroskopowo (post mortem).
Przewidywany wynik końcowy: Wynikiem badania będzie kompletna weryfikacja skuteczności modyfikacji wolnych płatów tkankowych poprzez wzbogacenie ich transdukowanymi mezenchymalnymi komórkami macierzystymi z tkanki tłuszczowej. Poza obiektywną oceną skuteczności, badanie pozwoli na dokładne opisanie modelu szczurzego brachyterapii biologicznej z autologicznymi zmodyfikowanymi komórkami. Stąd, możliwe będzie wykorzystanie wyników badania do komparatywnych badań innych nowotworów/białek przeciwnowotworowych.

Krążące mikroRNA (miRNA) wydzielane w większości przez płytki krwi może w istotny sposób wpływać na stężenie miRNA w osoczu, co daje możliwość monitorowania funkcji płytek krwi w populacjach pacjentów podwyższonego ryzyka sercowo-naczyniowego, w tym z cukrzycą typu 2. Obecnie wykorzystywane metody służące do oceny reaktywności płytek krwi mają wiele ograniczeń, co powoduje, że wartość rokownicza tak ocenianego zjawiska zwiększonej aktywności płytek krwi pozostaje niepewna. Dotychczas nie przeprowadzono badań, które oceniały potencjalny związek pomiędzy profilem krążących miRNA a rokowaniem u pacjentów z cukrzycą typu 2.

Najnowsze badania wskazują, że patogeneza nadciśnienia tętniczego może mieć związek z zaburzeniami w składzie flory jelitowej. Komensalne bakterie kolonizujące jelita metabolizują składniki pokarmowe wytwarzając szereg związków przedostających się do krwioobiegu. Celem proponowanego projektu jest zbadanie roli indolu, metabolitu bakterii jelitowych w regulacji ciśnienia tętniczego oraz rozwoju nadciśnienia tętniczego.
Przeprowadzone zostaną badania hemodynamiczne u zwierząt normotensyjnych (szczury WKY), hipertensyjnych (szczury SHR) oraz szczurów z granicznym ciśnieniem tętniczym (szczury BHR). Zostanie zbadany wpływ zwiększonego stężenia indolu w jelicie grubym, krwi obwodowej oraz płynie mózgowo-rdzeniowym na regulację ciśnienia tętniczego oraz rozwój nadciśnienia tętniczego. Ponadto zbadane zostaną możliwe mechanizmy, za pośrednictwem których indol mógłby oddziaływać na organizm.
Nadciśnienie tętnicze i jego powikłania są jednymi z głównych przyczyn zachorowalności i śmiertelności w Polsce i UE. Wyniki proponowanego badania mogą przyczynić się do zrozumienia roli indolu, metabolitu flory jelitowej w regulacji ciśnienia tętniczego oraz w patogenezie nadciśnienia tętniczego. Badanie pozwoli ocenić potencjał terapeutyczny donorów/inhibitorów syntezy indolu w chorobach układu krążenia, szczególnie w nadciśnieniu tętniczym.

Nawrotny częstoskurcz węzłowy (nawrotny częstoskurcz z węzła przedsionkowo-komorowego - AVNRT) jest jedną z najczęstszych arytmii nadkomorowych (SVT) występujących w populacji i poddawanych zabiegom ablacji (częstość w populacji ogólnej wynosi około 1:1000 osób).
Pomimo tak dużej częstości występowania AVNRT opublikowano do tej pory zaledwie kilka doniesień o rodzinnym występowaniu AVNRT (familial AVNRT- FAVNRT). Autorzy tych publikacji wskazywali na obecność FAVNRT najczęściej u dwóch członków rodziny z pokrewieństwem pierwszego stopnia. Dotychczas opublikowano dane w formie artykułów oryginalnych i doniesień abstraktowych o łącznie 41 rodzinach na świecie z potwierdzonym FAVNRT. Populacja chorych z FAVNRT z regionu Podkarpacia przedstawiona przez S. Steca oraz współautorów była najliczniejsza i stanowiła do 15% FAVNRT wśród kolejnych chorych kwalifikowanych do zabiegów ablacji z powodu AVNRT. Obserwacje te przekonują o istnieniu w regionie Podkarpacia unikalnej i najliczniejszej na świecie populacji rodzin z FAVNRT, a rozrysowane rodowody i rachunek prawdopodobieństwa przekonują o istnieniu genetycznych podstaw dla występowania FAVNRT w tej populacji.
Hipoteza badawcza:
1. Za występowanie AVNRT u osób z pokrewieństwem pierwszego bądź drugiego stopnia odpowiedzialne są czynniki genetyczne.
2. Częstość występowania AVNRT wśród członków rodzin z FAVNRT jest większa niż częstość występowania AVNRT w populacji ogólnej.

Cele badania:
1. Prowadzenie rejestru chorych z FAVNRT występującym w rejonie Podkarpacia celem dokładnego oceny charakterystyki klinicznej i występowania FAVNRT w tym rejonie Polski.
2. Ustalenia po raz pierwszy na świecie genetycznego podłoża dla występowania FAVNRT w populacji chorych AVNRT.
3. Określenie wpływu genetycznego podłoża FAVNRT na mechanizmy powstawania AVNRT oraz właściwości łącza przedsionkowo-komorowego w przewodzeniu innych arytmii serca.

Cel naukowy: Celem projektu będzie ocena rodzaju i przebiegu śmierci kardiomiocytów w żeńskim, szczurzym modelu kardiomiopatii Takotsubo (TTC) indukowanym isoprenaliną (ISO).
Stan wiedzy: Kardiomiopatia Takotsubo (TTC) charakteryzuje się ostrą, odwracalną skurczową niewydolnością lewej komory serca wywołaną przez stres emocjonalny i/lub fizyczny, występującą głównie u kobiet w wieku pomenopauzalnym. W TTC jest widoczna akineza segmentów koniuszkowych lewej komory serca (badanie echokardiograficzne) oraz jej swoisty skurczowy kształt (wentrykulografia). Patogeneza kardiomiopatii Takotsubo nie została dotychczas wyjaśniona. Sugeruje się, iż może ona wynikać z zaburzeń krążenia wieńcowego lub kardiotoksycznego działania katecholamin. Niedawno został opracowany męski, szczurzy model TTC wywołany poprzez dootrzewnowe podanie isoprenaliny- agonisty receptorów P1- i P2- adrenergicznych. Ostatnio nasz zespół badawczy opracował pierwszy żeński, szczurzy model TTC indukowany dootrzewnową iniekcją ISO. Nieliczne prace, w tym nasze wstępne opublikowane wyniki dotyczące zmian histopatologicznych w sercu w TTC, wskazują na obecność śmierci kardiomiocytów oraz towarzyszącej jej reakcji zapalnej. Nie wyjaśniono dotąd rodzaju śmierci kardiomiocytów w kardiomiopatii Takotsubo, jej wpływu na przebieg choroby oraz roli żeńskich hormonów płciowych w tych procesach. Wydaje się, że w szczególności trzy rodzaje śmierci kardiomiocytów mogą pojawiać się w przebiegu TTC, tj. apoptoza, nekroptoza i pyroptoza. Apoptoza jest programowaną śmiercią komórek, zależną od kaspazy 3. Nekroptoza łączy w sobie cechy programowanej apoptozy i nekrozy. Aktywacja szlaku nekroptozy wymaga rekrutacji białek RIPK1 (ang. Receptor-Interacting Protein Kinase 1) i/lub RIPK3 (ang. Receptor-Interacting Protein Kinase 3) oraz MLKL (ang. Mixed Lineage Kinase domain¬Like). Udowodniono również istotną rolę nekroptozy w indukcji reakcji zapalnej. Pyroptoza natomiast jest prozapalnym, programowanym rodzajem śmierci komórek, w którym kluczowym etapem jest rekrutacja cytosolowego kompleksu białkowego zwanego inflammasomem, m.in. NLRP3, aktywującego kaspazy 1 oraz 11, indukujące uwalnianie prozapalnych interleukin (IL): IL-1P i IL-18. Istnieją dane wskazujące na udział NLRP3 w patogenezie licznych chorób układu sercowo-naczyniowego. Białkiem bezpośrednio uczestniczącym w apoptozie kardiomiocytów, wywołanej stymulacją receptorów P1 - adrenergicznych oraz nekroptozie tych komórek z towarzyszącym zapaleniem jest kinaza typu II zależna od wapnia i kalmoduliny (CaMKII). Ekspresja tej kinazy wzrasta przy niskim poziomie estrogenów, co sugeruje, iż może mieć ona istotny wpływ na patogenezę TTC.
Metodyka i opis badań: Badania zostaną przeprowadzone u 160, 9-tygodniowych szczurów szczepu Sprague Dawley (SPRD) płci żeńskiej. Zwierzęta zostaną podzielone na 4 grupy doświadczalne (5 serii w każdej grupie, 8 zwierząt w serii). W 9 tyg. życia szczury będą poddane obustronnej owariektomii (grupy I i II) lub operacji pozorowanej (grupy III i IV). W 12 tyg. życia szczury otrzymają dootrzewnową iniekcję 150 mg/kg m.c. ISO (grupy II i IV) lub soli fizjologicznej (NaCl) (grupy I i III). W każdej z badanych grup po 6, 12, 24, 72 godzinach oraz 10 dniach od iniekcji ISO lub NaCl wykonane będzie przezklatkowe badanie echokardiograficzne oraz pobrane zostaną krew i serce do badań biochemicznych. W osoczu zostanie oznaczone stężenie kaspazy 1, 3, IL-1P, IL-18, RIPK1, RIPK3, MLKL oraz CaMKIIS (ELISA). W sercach będzie zbadana obecność kaspazy 1, 3, RIPK1, RIPK3, MLKL oraz CaMKIIS (Immunohistochemia).
Charakterystyka końcowego wyniku: Dotychczas nie scharakteryzowano procesu apoptozy, pyroptozyi nekroptozy w TTC, jak również nie wyjaśniono ich wpływu na przebieg powyższej jednostki chorobowej. Obecne badanie przybliży rolę procesu śmierci kardiomiocytów w TTC oraz wpływu żeńskich hormonów płciowych na występowanie powyższych rodzajów śmierci komórkowej, co w przyszłości będzie stanowiło punkt wyjścia do dalszych badań, mających na celu ustalenie skutecznej terapii celowanej. Ocena osoczowego stężenia białek biorących udział w apoptozie, nekroptozie i pyroptozie być może przyczyni się do wykrycia nowych markerów rokowniczych w TTC przydatnych w praktyce klinicznej.

Limfocyty T regulatorowe (Treg) odpowiadają za hamowanie odpowiedzi układu immunologicznego. Pełnią one kluczową rolę w prawidłowym działaniu układu odpornościowego. Ich nieprawidłową funkcję obserwuje się w wielu chorobach, takich jak choroby autoimmunizacyjne, alergie, a także w procesie odrzucania przeszczepów. Poszukiwanie związków indukujących te limfocyty lub wzmagających ich aktywność ma duże znaczenie w rozwoju nowych metod leczenia wielu chorób.
W proponowanych badaniach zostanie określony wpływ różnych immunomodulatorów i leków na aktywność limfocytów T regulatorowych. Z krwi obwodowej zdrowych dawców (z kożuszków leukocytarnych) zostaną wyizolowane limfocyty, a następnie w hodowli zostaną wyindukowane limfocyty Treg (limfocyty działające supresyjnie na odpowiedź immunologiczną). W dotychczasowych wstępnych badaniach zaobserwowaliśmy, że kwas masłowy oraz pranobeks inozyny zwiększają ilość limfocytów Treg (fenotyp CD4+CD25hl9hFoxp3+) w hodowli. Ponadto zostaną zbadane takie terapeutyki, jak rapamycyna, octan glatirameru, atorwastatyna, witamina D3 oraz prednizolon.
W kolejnym etapie wykazane zostanie, czy badane związki wpływają na funkcjonalność limfocytów Treg. W tym celu zostanie zastosowany test czynnościowy, określający jak zmienia się czynność limfocytów w zależności od zastosowanego leku. Test ten pozwoli określić, czy terapeutyki te mogłyby potencjalnie zostać wykorzystane w celu pobudzenia aktywności patologicznych limfocytów T regulatorowych u chorych z ich defektem. Będzie on polegał na zbadaniu zdolności limfocytów Treg, po ich inkubacji z badanymi lekami, do zahamowania proliferacji limfocytów efektorowych.
W ostatnim etapie doświadczeń zostanie zbadane, czy testowane leki mogą mieć zastosowanie terapeutyczne u chorych na miastenię - reprezentatywną chorobę autoimmunizacyjną. Limfocyty Treg u chorych z tej grupy mają upośledzoną funkcję, co jest jednym z powodów wystąpienia choroby. Zostaną wyizolowane limfocyty z krwi obwodowej chorych ze świeżo zdiagnozowaną miastenią, a następnie w hodowli in vitro zostaną wyindukowane limfocyty Treg. Następnie zostanie określone, czy immunomodulatory przywracają prawidłową aktywność patologicznych limfocytów w teście czynnościowym opisanym powyżej z zastosowaniem, jako stymulatorów swoistych reakcji, peptydów wywodzących się z receptorów dla acetylocholiny (AChR).
Proponowane badania mogą mieć znaczenie w leczeniu m.in. chorób autoimmunizacyjnych, alergii, choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi, bądź w indukowaniu tolerancji transplantacyjnej.