Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego

Cel naukowy: Celem projektu będzie ocena rodzaju i przebiegu śmierci kardiomiocytów w żeńskim, szczurzym modelu kardiomiopatii Takotsubo (TTC) indukowanym isoprenaliną (ISO).
Stan wiedzy: Kardiomiopatia Takotsubo (TTC) charakteryzuje się ostrą, odwracalną skurczową niewydolnością lewej komory serca wywołaną przez stres emocjonalny i/lub fizyczny, występującą głównie u kobiet w wieku pomenopauzalnym. W TTC jest widoczna akineza segmentów koniuszkowych lewej komory serca (badanie echokardiograficzne) oraz jej swoisty skurczowy kształt (wentrykulografia). Patogeneza kardiomiopatii Takotsubo nie została dotychczas wyjaśniona. Sugeruje się, iż może ona wynikać z zaburzeń krążenia wieńcowego lub kardiotoksycznego działania katecholamin. Niedawno został opracowany męski, szczurzy model TTC wywołany poprzez dootrzewnowe podanie isoprenaliny- agonisty receptorów P1- i P2- adrenergicznych. Ostatnio nasz zespół badawczy opracował pierwszy żeński, szczurzy model TTC indukowany dootrzewnową iniekcją ISO. Nieliczne prace, w tym nasze wstępne opublikowane wyniki dotyczące zmian histopatologicznych w sercu w TTC, wskazują na obecność śmierci kardiomiocytów oraz towarzyszącej jej reakcji zapalnej. Nie wyjaśniono dotąd rodzaju śmierci kardiomiocytów w kardiomiopatii Takotsubo, jej wpływu na przebieg choroby oraz roli żeńskich hormonów płciowych w tych procesach. Wydaje się, że w szczególności trzy rodzaje śmierci kardiomiocytów mogą pojawiać się w przebiegu TTC, tj. apoptoza, nekroptoza i pyroptoza. Apoptoza jest programowaną śmiercią komórek, zależną od kaspazy 3. Nekroptoza łączy w sobie cechy programowanej apoptozy i nekrozy. Aktywacja szlaku nekroptozy wymaga rekrutacji białek RIPK1 (ang. Receptor-Interacting Protein Kinase 1) i/lub RIPK3 (ang. Receptor-Interacting Protein Kinase 3) oraz MLKL (ang. Mixed Lineage Kinase domain¬Like). Udowodniono również istotną rolę nekroptozy w indukcji reakcji zapalnej. Pyroptoza natomiast jest prozapalnym, programowanym rodzajem śmierci komórek, w którym kluczowym etapem jest rekrutacja cytosolowego kompleksu białkowego zwanego inflammasomem, m.in. NLRP3, aktywującego kaspazy 1 oraz 11, indukujące uwalnianie prozapalnych interleukin (IL): IL-1P i IL-18. Istnieją dane wskazujące na udział NLRP3 w patogenezie licznych chorób układu sercowo-naczyniowego. Białkiem bezpośrednio uczestniczącym w apoptozie kardiomiocytów, wywołanej stymulacją receptorów P1 - adrenergicznych oraz nekroptozie tych komórek z towarzyszącym zapaleniem jest kinaza typu II zależna od wapnia i kalmoduliny (CaMKII). Ekspresja tej kinazy wzrasta przy niskim poziomie estrogenów, co sugeruje, iż może mieć ona istotny wpływ na patogenezę TTC.
Metodyka i opis badań: Badania zostaną przeprowadzone u 160, 9-tygodniowych szczurów szczepu Sprague Dawley (SPRD) płci żeńskiej. Zwierzęta zostaną podzielone na 4 grupy doświadczalne (5 serii w każdej grupie, 8 zwierząt w serii). W 9 tyg. życia szczury będą poddane obustronnej owariektomii (grupy I i II) lub operacji pozorowanej (grupy III i IV). W 12 tyg. życia szczury otrzymają dootrzewnową iniekcję 150 mg/kg m.c. ISO (grupy II i IV) lub soli fizjologicznej (NaCl) (grupy I i III). W każdej z badanych grup po 6, 12, 24, 72 godzinach oraz 10 dniach od iniekcji ISO lub NaCl wykonane będzie przezklatkowe badanie echokardiograficzne oraz pobrane zostaną krew i serce do badań biochemicznych. W osoczu zostanie oznaczone stężenie kaspazy 1, 3, IL-1P, IL-18, RIPK1, RIPK3, MLKL oraz CaMKIIS (ELISA). W sercach będzie zbadana obecność kaspazy 1, 3, RIPK1, RIPK3, MLKL oraz CaMKIIS (Immunohistochemia).
Charakterystyka końcowego wyniku: Dotychczas nie scharakteryzowano procesu apoptozy, pyroptozyi nekroptozy w TTC, jak również nie wyjaśniono ich wpływu na przebieg powyższej jednostki chorobowej. Obecne badanie przybliży rolę procesu śmierci kardiomiocytów w TTC oraz wpływu żeńskich hormonów płciowych na występowanie powyższych rodzajów śmierci komórkowej, co w przyszłości będzie stanowiło punkt wyjścia do dalszych badań, mających na celu ustalenie skutecznej terapii celowanej. Ocena osoczowego stężenia białek biorących udział w apoptozie, nekroptozie i pyroptozie być może przyczyni się do wykrycia nowych markerów rokowniczych w TTC przydatnych w praktyce klinicznej.

Limfocyty T regulatorowe (Treg) odpowiadają za hamowanie odpowiedzi układu immunologicznego. Pełnią one kluczową rolę w prawidłowym działaniu układu odpornościowego. Ich nieprawidłową funkcję obserwuje się w wielu chorobach, takich jak choroby autoimmunizacyjne, alergie, a także w procesie odrzucania przeszczepów. Poszukiwanie związków indukujących te limfocyty lub wzmagających ich aktywność ma duże znaczenie w rozwoju nowych metod leczenia wielu chorób.
W proponowanych badaniach zostanie określony wpływ różnych immunomodulatorów i leków na aktywność limfocytów T regulatorowych. Z krwi obwodowej zdrowych dawców (z kożuszków leukocytarnych) zostaną wyizolowane limfocyty, a następnie w hodowli zostaną wyindukowane limfocyty Treg (limfocyty działające supresyjnie na odpowiedź immunologiczną). W dotychczasowych wstępnych badaniach zaobserwowaliśmy, że kwas masłowy oraz pranobeks inozyny zwiększają ilość limfocytów Treg (fenotyp CD4+CD25hl9hFoxp3+) w hodowli. Ponadto zostaną zbadane takie terapeutyki, jak rapamycyna, octan glatirameru, atorwastatyna, witamina D3 oraz prednizolon.
W kolejnym etapie wykazane zostanie, czy badane związki wpływają na funkcjonalność limfocytów Treg. W tym celu zostanie zastosowany test czynnościowy, określający jak zmienia się czynność limfocytów w zależności od zastosowanego leku. Test ten pozwoli określić, czy terapeutyki te mogłyby potencjalnie zostać wykorzystane w celu pobudzenia aktywności patologicznych limfocytów T regulatorowych u chorych z ich defektem. Będzie on polegał na zbadaniu zdolności limfocytów Treg, po ich inkubacji z badanymi lekami, do zahamowania proliferacji limfocytów efektorowych.
W ostatnim etapie doświadczeń zostanie zbadane, czy testowane leki mogą mieć zastosowanie terapeutyczne u chorych na miastenię - reprezentatywną chorobę autoimmunizacyjną. Limfocyty Treg u chorych z tej grupy mają upośledzoną funkcję, co jest jednym z powodów wystąpienia choroby. Zostaną wyizolowane limfocyty z krwi obwodowej chorych ze świeżo zdiagnozowaną miastenią, a następnie w hodowli in vitro zostaną wyindukowane limfocyty Treg. Następnie zostanie określone, czy immunomodulatory przywracają prawidłową aktywność patologicznych limfocytów w teście czynnościowym opisanym powyżej z zastosowaniem, jako stymulatorów swoistych reakcji, peptydów wywodzących się z receptorów dla acetylocholiny (AChR).
Proponowane badania mogą mieć znaczenie w leczeniu m.in. chorób autoimmunizacyjnych, alergii, choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi, bądź w indukowaniu tolerancji transplantacyjnej.

Chłoniaki nieziarnicze stanowią około 2% ogółu nowotworów złośliwych w Polsce, a zachorowalność na nie wzrastała systematycznie w ostatnich dekadach. Mimo szerokiej dostępności różnych form leczenia odpowiedź pacjentów na terapię nie jest zadawalająca. Istotnym problemem jest oporność komórek nowotworowych na stosowane leki.
Kluczową rolę w powstawaniu oporności na chemioterapię odgrywa szlak PI3/AKT Dane literaturowe pokazują, że niektóre ze stosowanych w chorobach limfoproliferaecyjnych chemioterapeutyków mogą aktywować kina/e AKT. Wyniki naszych badań wykazały, że kinaza AK T może z kolei regulować ilość antygenu CD20 - białka docelowego dla terapeutycznych przeciwciał monoklonalnych stosowanych również w terapii chłoniaków. Większość stosowanych obecnie schematów leczniczych opiera się na łączeniu chemioterapeutyków z immunoterapią. Stąd poznanie wzajemnych oddziaływań między tymi dwiema grupami leków jest niezwykle ważne w kontekście wybierania jak najkorzystniejszych kombinacji tych leków.
Celem naukowym projektu jest zbadanie wpływu wybranych chemioterapeutyków na ilość antygenu CD20 w komórkach nowotworowych i na skuteczność działania terapeutycznych przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko tej cząsteczce. Doświadczenia zamierzamy przeprowadzić w modelach ustalonych linii komórkowych wywodzących się z limfocytów B a także na komórkach wyizolowanych od pacjentów z rozrostami hematologicznymi.
Wyniki naszych badań umożliwią wyselekcjonowanie chemioterapeutyków. które mogłyby zwiększać efektywność immunoterapii aiUy-CD20. Umożliwi to zaproponowanie najkorzystniejszych schematów terapii kombinowanej z zastosowaniem obu grup Icków, W szerszej perspektywie nasz projekt przyczyni się do lepszego poznania mechanizmów oporności wtórnej na chemioterapeutyki.