Narodowe Centrum Nauki

Kwiat lipy (Tiliae flos) jest popularnym lekiem roślinnym stosowanym w postaci naparów w celu łagodzenia i leczenia objawów przeziębienia, takich jak ból gardła, kaszel czy podwyższona temperatura. Tiliae flos posiada swoją monografię w Farmakopei Europejskiej 8.0, która definiuje tę substancję roślinną jako całe, wysuszone kwiaty pozyskane z lipy szerokolistnej (Tilia platyphyllos L.), drobnolistnej (Tilia cordata Mill.) oraz holenderskiej (Tilia x vulgaris Hayne) bądź będący mieszaniną wymienionych trzech gatunków. Chociaż kwiat lipy uchodzi za dobrze poznany surowiec roślinny, w dostępnym piśmiennictwie nadal brakuje badań dotyczących składu chemicznego oraz aktywności biologicznej wyciągów przygotowywanych z kwiatów pozyskanych z farmakopealnych gatunków lipy. Głównym celem przedstawianego projektu jest kompleksowa analiza fitochemiczna wyciągów przygotowanych z kwiatów lipy zebranych z farmakopealnych gatunków lipy oraz ocena ich aktywności przeciwzapalnej z użyciem modelu ludzkich neutrofili. W trakcie projektu przeprowadzone zostaną porównania składu poszczególnych wyciągów z uwzględnieniem analizy chemometrycznej otrzymanych wyników oraz porównanie aktywności biologicznej badanego materiału pozyskanego z trzech farmakopealnych gatunków lipy (T. platyphyllos, T. cordata, T. x vulgaris) oraz dwóch gatunków nie stanowiących źródła farmakopealnej substancji roślinnej – Tilia americana L. oraz Tilia tomentosa Moench.
Planowane badania zostaną przeprowadzone z użyciem próbek kwiatu lipy zebranych ze stanu naturalnego wiosną/latem 2014, 2015 oraz 2016. Badania będą skupione na próbkach pozyskanych z trzech farmakopealnych gatunków tej rośliny (T. platyphyllos, T. cordata and T. x vulgaris) oraz dwóch niefarmakopealnych gatunków (T. tomentosa and T. americana) wymienianych jako najczęstsze zanieczyszczania tej substancji leczniczej. Komercyjne próbki zawierające kwiat lipy zostaną również zakupione i poddane analizie. Analiza fitochemiczna będzie oparta na nowoczesnych technikach analitycznych, takich jak UHPLC-DAD-MS/MS oraz HPTLC. Obie metody zostaną zoptymalizowane w trakcie prowadzonych badań. Napary przygotowane z wybranych pięciu gatunków lipy zostaną scharakteryzowane pod względem składników w nich występujących na podstawie otrzymanych danych. Wszystkie ekstrakty ze szczególnym uwzględnieniem ekstraktów przeznaczonych do badań biologicznych zostaną poddane standaryzacji z użyciem zwalidowanej metody UHPLC oraz prostszych metod chemicznych celem oznaczenia ilościowego poszczególnych związków i grup związków w nich występujących. Cześć izolacyjna badań fitochemicznych będzie dotyczyła kwiatów otrzymanych z T. cordata. Stosując techniki chromatograficzne takie jak chromatografia kolumnowa, chromatografia typu flash oraz preparatywna HPLC wyizolowane zostaną główne składniki występujące w ekstrakcie przygotowanym z kwiatów T. cordata. Oczyszczone związki zostaną zidentyfikowane z użyciem metod spektroskopowych i spektrometrycznych, takich jak 1D oraz 2D NMR, UV-Vis czy HR-MS. Wyniki badań fitochemicznych zostaną poddane analizie chemometrycznej z użyciem metod statystycznych, takich jak analiza głównych składowych (PCA) czy diagraficzna metoda Czekanowskiego (HCA). Pozwoli to na stwierdzenie różnic w składzie chemicznym pomiędzy naparami otrzymanymi z kwiatów pięciu wybranych gatunków lip oraz określenie czy obserwowane różnice są statystycznie znamienne. W trakcie badań biologicznych oceniony zostanie potencjał przeciwzapalny przygotowanych wyciągów. Określony zostanie wpływ ekstraktów na funkcje prozapalne neutrofili ludzkich, takie jak uwalnianie reaktywnych form tlenu, enzymów proteolitycznych (elastazy, metaloproteinazy z użyciem metod spektrofotometrycznych wykorzystywanych w laboratorium kierownika projektu. Zbadany zostanie również wpływ na produkcję cytokin, takich jak interleukiny-8 oraz 1β stosując gotowe testy ELISA. W toku badań określone zostaną również właściwości przeciwbakteryjne analizowanych ekstraktów. Stosując szczepy bakterii z grupy paciorkowców wyznaczone zostaną minimalne stężenia hamujące wzrost bakterii oraz minimalne stężenia bakteriobójcze.
Proponowany projekt jest skupiony na badaniach podstawowych dotyczących składu chemicznego farmakopealnej substancji roślinnej – Tiliae flos. Otrzymane wyniki przyczynią się do znaczącego poszerzenia dotychczasowej wiedzy na temat składu chemicznego tego leku, wskażą czy istnieją istotne różnice w składzie chemicznym kwiatów pochodzących z pięciu wybranych gatunków tej rośliny. Planowane badania wskażą, jaką metodę standaryzacji należy zastosować w przypadku kwiatu lipy co będzie miało bezpośredni wpływ na podniesienie bezpieczeństwa i skuteczności stosowania naparów z tej substancji roślinnej. Badania biologiczne wykażą czy napary z kwiatu lipy posiadają zdolność do regulowania odpowiedzi zapalnej neutrofili ludzkich oraz zdolność do hamowania rozwoju bakterii z grupy paciorkowców. Wyniki przeprowadzonych badań będą mogły przyczynić się do potwierdzenia zasadności stosowania naparów z kwiatów lipy jako łagodnego środka przeciwzapalnego oraz przeciwbakteryjnego.

W ostatnich latach odkryto, że stosowany w uzależnieniu od etanolu disulfiram (DSF) jest skuteczny w leczeniu uzależnienia od kokainy, za co prawdopodobnie odpowiada blokowanie aktywności beta-hydroksylazy dopaminowej (DBH). Związkiem będącym selektywnym inhibitorem DBH jest nepikastat. Wyniki badań przedklinicznych wskazują, że nepikastat jest także skuteczny w zmniejszaniu objawów zależności kokainowej. Niestety, w piśmiennictwie brak danych na temat wpływu DSF oraz nepikastatu na uzależniające działanie opioidów oraz na rozwój tolerancji, We wstępnych badaniach własnych wykazano, że DSF łagodzi objawy odstawienne po podaniu metadonu (n=IO) i morfiny (n=5) oraz zmniejsza tolerancję na działanie przeciwbólowe tych opioidów. Celem obecnego projektu jest ocena działania DSF oraz nepikastatu na rozwój zależności fizycznej oraz psychicznej po wielokrotnym podawaniu morfiny, a także na rozwój tolerancji na działanie przeciwbólowe morfiny. Planuje się także zbadać mechanizmy biorące udział w działaniu DSF i nepikastatu, ze szczególnym uwzględnieniem roli DBH i receptorów glutaminianergicznych. Postawiono następujące hipotezy badawcze: (1) DSF i nepikastat łagodzą rozwój fizycznej zależności morfinowej; (2) DSF i nepikastat łagodzą rozwój tolerancji na działanie przeciwbólowe morfiny; (3) DSF i nepikastat łagodzą rozwój psychicznej zależności morfinowej; (4) Mechanizm działania DSF i nepikastatu jest związany z jego wpływem na aktywność DBH i/lub receptory glataminianergiczne.
W poszczególnych etapach badań wykorzystane zostaną następujące metody badawcze:
I. Badania zależności fizycznej - ocena objawów zespołu abstynencyjnego. Wpływ DSF i nepikastatu na rozwój zależności fizycznej po podaniu morfiny zostanie zweryfikowany poprzez ocenę stopnia nasilenia objawów zespołu abstynencyjnego, wywołanego podaniem naloksonu.
II. Badanie wpływu DSF i nepikastatu na rozwój tolerancji na działanie przeciwbólowe morfiny w modelach behawioralnych. W celu oceny tolerancji na działanie przeciwbólowe morfiny oraz weryfikacji wpływu badanych substancji na jej rozwój zostanie zastosowany model bólu ostrego. Działanie analgetyczne oceniane będzie przez pomiar progu czucia bodźca mechanicznego wg modyfikacji metody Randall-Selitto, a także pomiar progu czucia bodźca termicznego w teście tail-flick.
III. Badanie właściwości nagradzających i motywacyjnych morfiny oraz nawrotu do jej zachowań poszukiwawczych. W badaniu zostanie wykorzystany model dożylnego samopodawania morfiny. W celu oceny wpływu DSF/nepikastatu na wygaszenie/nawrót zachowań poszukiwawczych w odniesieniu do morfiny, badane związki będą podawane wielokrotnie w okresie odstawienia od morfiny lub jednorazowo (w trzech wybranych dawkach) w fazie nawrotu wywołanego bodźcem bezwarunkowym (morfina) lub warunkowym (światło+dźwięk kojarzone z jej samopodawaniem).
IV. Badania neurochemiczne i molekularne. Dla wyjaśnienia mechanizmów działania DSF i nepikastatu
zastosowane będą procedury neurochemiczne (mikrodializa in vivo i analiza stężeń DA i glutaminianu przy użyciu metody HPLC) oraz molekularne (analiza ekspresji białek receptorów glutaminianergicznych i białka DBH w wybranych strukturach mózgu metodą Western biot).
Wszystkie wymienione wyżej metody stanowią uznane na całym świecie w odnośnych okolicznościach metodyki badawcze.
Proponowane badania prowadzą do generowania nowej wiedzy na temat podłoża molekularnego uzależnień. Zrozumienie mechanizmu działania DSF może być pomocne w tworzeniu nowych leków przeciwko uzależnieniom. Uzależnienie od opioidów nadal stanowi poważny problem medyczny oraz społeczno-ekonomiczny w skali globalnej, zaś skuteczne leki nie są dostępne. Duży rozmiar populacji dotkniętej uzależnieniem od opioidów wraz z niedostatkami terapii prowadzi także do znacznych strat ekonomicznych. Podjęcie planowanych badań jest więc uzasadnione także względami społeczno-ekonomicznymi.

W chorobach neuropsychiatrycznych dochodzi do zaburzenia kontroli aktywności neuronów kory przedczołowej przez małe neuroprzekaźniki: dopaminę, serotoninę, acetylocholinę lub noradrenalinę. Wymienione neuroprzekaźniki aktywują błonowe receptory metabotropowe, które wywołują zmiany spoczynkowych prądów błonowych, a w konsekwencji zmiany aktywności neuronów. Zaburzenie działania tych systemów prowadzi do zmienionej patologicznie aktywności neuronów kory przedczołowej i zaburzenia zachowania organizmu w środowisku. W celu korekty zaburzonej kontroli aktywności neuronów kory przedczołowej przez małe neuroprzekaźniki należy poznać mechanizm ich działania na poziomie komórkowym u zdrowych osobników. Kontrola neuronów kory przedczołowej przez receptory adrenergiczne jest stosunkowo mało poznana. Uważa się, że przekazywanie sygnału w neuronach kory przedczołowej od receptorów adrenergicznych do elektorów komórkowych (kanałów jonowych) jest zaburzone między innymi w zespole stresu pourazowego, schizofrenii, zaburzeniach nastroju oraz zaburzeniach lękowych. Występowanie tych patologii zależy od wieku osobnika. Celem projektu jest zbadanie mechanizmów odpowiedzialnych za kontrolę spoczynkowych prądów błonowych w neuronach piramidowych kory przedczołowej przez receptory adrenergiczne.
W szczególności zamierzam zbadać:
• Jakie podtypy błonowych receptorów adrenergicznych są odpowiedzialne za zmianę spoczynkowych prądów błonowych w neuronach piramidowych?
• Jakie podtypy kanałów jonowych (efektorów komórkowych) odpowiedzialnych za spoczynkowe prądy błonowe są kontrolowane przez receptory adrenergiczne?
• Które wtórne przekaźniki błonowe i/lub cytoplazmatyczne pośredniczą w przekazywaniu sygnału od receptorów adrenergicznych do kanałów jonowych?
• Czy kontrola spoczynkowych prądów błonowych przez receptory adrenergiczne jest odmienna u szczurów młodych, w wieku dojrzewania i dorosłych?
Celem projektu jest zbadanie mechanizmów odpowiedzialnych za kontrolę spoczynkowych prądów błonowych w neuronach piramidowych kory przedczołowej przez receptory adrenergiczne. Prądy błonowe będą rejestrowane w skrawkach z neuronów piramidowych warstwy V kory przedczołowej. Skrawki będą pobierane z części przyśrodkowej kory przedczołowej szczurów młodych (20-dniowych), w wieku dojrzewania (40-dniowych) i dorosłych (60-dniowych). Rejestracje prądów zostaną wykonane metodą perforowanych łatek w temperaturze 34°C z wykorzystaniem gramicydyny rozpuszczonej w płynie w pipecie. Jeśli będzie to konieczne, prądy błonowe zostaną zarejestrowane z neuronów rozproszonych z zastosowaniem klasycznej metody stabilizacji potencjału na całej powierzchni błony komórkowe (whole-cell vollagc-clamp). Agoniści receptorów adrenergicznych, blokery efektorów komórkowych i systemu transdukcji sygnału wewnątrzkomórkowego inne będą dodawane do komory rejestracyjnej lub do płynu w pipecie. Analizowany będzie wpływ tych związków na spoczynkowe prądy błonowe. W swoich badaniach określę proces przekazywania sygnału od receptorów adrenergicznych do efektorów komórkowych w neuronach piramidowych kory przedczołowej. Badania te są istotne, ponieważ: a. zaburzona funkcja na jednym z etapów przekazywania sygnału może prowadzić do rozwoju chorób neuropsychiatrycznych oraz b. wszystkie elementy szlaku przekazywania sygnału są potencjalnym punktem uchwytu do działania dla substancji biologicznie czynnych podawanych w celu przywrócenia prawidłowej funkcji neuronów.

Jednym z głównych problemów współczesnej medycyny jest narastające zjawisko oporności mikroorganizmów będące wynikiem niekontrolowanego stosowania antybiotykoterapii Corocznie w krajach Unii Europejskiej umiera z powodu iniekcji wywołanych bakteriami opornymi na antybiotyki ok. 25 000 osób. Celem projektu są badania nad syntezą, właściwościami fizykochemicznymi i biologicznymi wielkocząsteczkowych nośników peptydów przeciwdrobnoustrojowych. Określony zostanie wpływ topologii matryc polimerowych, zawartości i dystrybucji AMPs związanych z matrycą na efektywność układów polimer-peptyd. Ponadto określona zostanie kinetyka uwalniania substancji aktywniej z matryc polimerowych oraz skuteczność działania nowych układów w testach mikrobiologicznych. Matryce polimerowe będą otrzymywane w wyniku polimeryzacji z otwarciem pierścienia cyklicznych monomerów (ROP) wobec wybranych biokalalizalorów (lipaz). Otwarcie pierścienia omija etap generowania grup odchodzących, który może ograniczać szybkość propagacji i ciężar cząsteczkowy produktu. Zastosowanie enzymów w procesie polimeryzacji pozwoli uniknąć toksycznych pozostałości po klasycznych katalizatorach metaloorganicznych. Synteza matryc polimerowych będzie prowadzona w rozpuszczalnikach organicznych. Jak pokazują wyniki badań eksperymentalnych, pozwala to na wyższą niż w środowisku wodnym enancjoseleklywność oraz termostabilność lipaz. Jako medium reakcyjne ze względu na niską prężność par, wysoką stabilność termiczną i chemiczną, zostaną wytypowane ciecze jonowe (ILs). Lipazy w środowisku cieczy jonowych (o określonej strukturze) wykazują wyższą niż tradycyjnych rozpuszczalnikach organicznych aktywność i selektywność. Po zakończonym procesie produkty reakcji będzie można w łatwy sposób odseparować np. poprzez ekstrakcję. Synteza nośników będzie prowadzona w reaktorze klasycznym i mikrofalowym. Stosowanie promieniowania mikrofalowego ma wiele zalet: jest to proces przyjazny środowisku, ponieważ pozwala znacznie przyspieszyć czas trwania reakcji, zachowując przy tym kontrolę nad jej przebiegiem. Do przygotowanych matryc polimerowych będą przyłączane peptydy m.in. na drodze estryfikacji grup funkcyjnych peptydów i otrzymanych polimerów oraz na drodze poliaddycji przy użyciu alifatycznych i cykloalifatycznych diizocyjanianów. W projekcie zostaną zastosowane komercyjnie dostępne peptydy oraz nowe, syntetyczne analogi peptydów, m.in. eitropina 1.l. protegryna 1, teporyna A. amiganan MDI 226, pexiganan MSI 78 syntetyzowane przy współpracy (jak w dotychczasowych badaniach) z Gdańskim Uniwersytetem Medycznym. Peptydy będą syntetyzowane metodą Fmoc w reaktorze mikrofalowym na nośniku polistyrenowym (żywica polistyrenowa modyfikowana linkerem Rink-amidowym) Struktura otrzymanych, wielkocząteczkowych koniugatów peptydów antydrobnoustrojowych, będzie określana za pomocą szeregu metod instrumentalnych: 1H i 13C, CP/MAS, UV-Vis, ET1R, GPC, SEM a właściwości termiczne za pomocą DSC-TG. W zależności od struktury koniugatu i zawartości substancji aktywnej określona zostanie zdolność i szybkość degradacji hydrolitycznej w roztworach buforowych oraz biodegradacja w obecności hydrolaz. Skuteczność wytworzonych, nowych układów nośnik-AMP będzie badana w testach mikrobiologicznych. Biozgodność, cytotoksyczność i genotoksyczność będzie weryfikowana w warunkach in vitro za pomocą szybkich testów diagnostycznych. W projekcie zostanie zweryfikowana skuteczność i możliwość zastosowania wytworzonych matryc jako nośników peptydów przeciwdrobnoustrojowych. Zostanie wykazana zależność pomiędzy strukturą otrzymanych biomateriałów' a kinetyką uwalniania substancji aktywnej. W dalszej perspektywie rezultaty projektu mogą przyczynić się do rozwoju badań o charakterze aplikacyjnym w walec z lekoopornością mikroorganizmów' Projekt jest interdyscyplinarny i rezultaty otrzymane po jego zakończeniu mogą wnieść znaczący udział w rozwój chemii medycznej, chemii farmaceutycznej, chemii biomateriałów i farmacji.

Celem projektu będzie synteza i określenie aktywności biologicznej nowych pochodnych pirydo [1,2-c] pirymidyny, związków o podwójnej wiązalności do 5-HT1AR oraz SERT. Wyniki badań biologicznych in vitro i in vivo pozwolą na ocenę wpływu dokonanych modyfikacji struktury związków na ich aktywność biologiczną. Przesłanką badań jest otrzymanie nowego antydepresanta III generacji z grupy SSRI + lub MTA (Multi Target Agents). Prowadzone badania nad obiema grupami (SSRI + , MTA) należą do wiodących kierunków badań chemii medycznej nad nowym lekiem przeciwdepresyjnym, a w przypadku poszukiwań w grupie MTA - do badań pionierskich. W realizacji celu badań wykorzystana będzie wiedza z zakresu chemii medycznej, fizykochemii, farmakokinetyki, farmakologii oraz badań in silico, którą dysponuje zespół realizujący projekt.
Realizacja celu badań projektu oparta będzie o następującą metodykę:
- zaprojektowanie struktur ligandów w oparciu o analogie strukturalne ze znanymi ligandami o wiązalności do 5-HT1AR lub SERT, modyfikacje struktur wiodących oraz wstępne wyniki modelowania molekularnego
- otrzymanie na drodze wieloetapowej syntezy chemicznej wyjściowych syntonów do otrzymania związków finalnych; synteza związków finalnych zaplanowanych w projekcie w pięciu niezależnych szeregach (planowana jest synteza ponad 60 nowych związków);
- przygotowanie próbek analitycznych do badań fizykochemicznych i biologicznych oraz ocena ich czystości (HPLC);
- potwierdzenie struktury chemicznej (metodami spektroskopii IR, NMR) i składu (analiza elementarna oraz spektrometria HRMS), prowadzona dla wszystkich związków finalnych;
- badanie in vitro powinowactwa do 5-HT1AR i SERT przy użyciu odpowiednich radioligandów (dla wszystkich związków finalnych);
- badania radioreceptorowe in vitro w poszerzonym profilu receptorowym (5-HT2A, 5-HT2c, 5-HT6, 5-HT7, α i D2) dla ligandów wykazujących najwyższe powinowactwo do jednego z celów molekularnych 5-HT1AR lub SERT,
- badanie in vivo aktywności funkcjonalnej wobec pre- i postsynaptycznych receptorów 5-HT1A (test indukowanej hipotermii u muszy i test LLR u szczurów);
- badanie trwałości w fazie I przejścia dla wybranych ligandów z obu szeregów (badanie ADME);
- badanie aktywności przeciwdepresyjnej dla związków wykazujących najwyższe wiązalności do 5-HT1AR i SERT oraz posiadających największą trwałość w fazie I przejścia (test Porsolta i test ruchliwości);
- badanie in silico dla ligandów obu szeregów (dokowanie molekularne, SAR);
- analiza SAR dla wszystkich przebadanych związków;
optymalizacja struktury w oparciu o analizę SAR, ADME oraz badania in silico, która może w istotny sposób wpłynąć na efektywne poszukiwanie struktury wiodącej w badaniach nad nowymi antydepresantami z grupy SSRI i lub MTA.
Prowadzona w ramach projektu synteza wniesie wkład w wiedzę z zakresu chemii medycznej związków heterocyklicznych wykazujących aktywnością biologiczną. Obiecujące wyniki wcześniejszych badań nad pochodnymi pirydo[1,2-c]pirymidyny wskazują na duże prawdopodobieństwo otrzymania ligandów o wysokim powinowactwie do 5-HT1AR oraz SERT, co może prowadzić do uzyskania skutecznego nowego leku przeciwdepresyjnego III-generacji z grupy SSRI. Natomiast planowane badania nad ligandami z grupy MTA mogą prowadzić do antydepresanta o nowym mechanizmie działania, skróconym okresie latencji i większej skuteczności w porównaniu z najczęściej stosowanymi w farmakoterapii depresji lekami Il-giej generacji z grupy SSRI. Wyniki badań biologicznych przewidzianych w projekcie pozwolą na wyznaczenie wpływu dokonanych modyfikacji struktury ligandów na wiązalność do 5-HT|AR i SERT, optymalizację struktury wiodącej prowadzącej do uzyskania nowych związków o aktywności przeciwdepresyjnej w grupie SSRH lub MTA.

Celem przedstawionego projektu jest otrzymanie na drodze biosyntezy serii nowych, nieopisanych dotąd związków wielkocząsteczkowych - egzopolisacharydów pochodzenia grzybowego (β-glukanów) zawierających w swojej strukturze atomy selenu, a następnie zbadanie wpływu inkorporacji selenu do łańcucha polisacharydowego na ich cechy strukturalne oraz aktywność immunomodulacyjną. Przedstawiony projekt stanowi kontynuację badań prowadzonych w latach 2010-2011, w ramach projektu badawczego własnego MEiN N N405 613238. W wyniku przeprowadzonych w tym okresie badań zoptymalizowano warunki hodowli mycelium L. edodes na podłożach wzbogacanych w związki selenu, przeprowadzono badania specjacyjne organicznych związków selenu biosyntezowanych przez kultury mycelialne, oraz wyizolowano jedną frakcję polisacharydową zawierającą selen. Wstępne badania wpływu wyizolowanej selenowanej frakcji polisacharydowej na proliferację limfocytów krwi ludzkiej wskazały na jej silne i selektywne działanie immunosupresyjne, przy bardzo niskiej toksyczności. Wyniki badań były na tyle obiecujące, że ewentualne zastosowanie otrzymywanych na drodze biosyntezy selenowanych polisacharydów jako immunosupresantów zostało w 2012 roku objęte zgłoszeniem patentowym (P. 402082). Zarówno mechanizm inkorporacji selenu do cząsteczek egzopolisacharydów grzybowych, jak ich budowa i mechanizm wykrytego przez nas we wstępnych badaniach działania immunosupresyjnego są dotąd nieznane. W przedstawionym obecnie projekcie zaplanowano w związku z tym badania mające na celu wyjaśnienie tego interesującego problemu. Dotyczą one równocześnie niezbadanej dotąd problematyki biosyntezy, struktury oraz mechanizmu działania selenopolisacharydów.
Zamierzamy w trzech dziedzinach prowadzonych badań wykorzystać metody:
W części biotechnologicznej badań:
- Biosyntezę wzbogaconych w selen egzoplisacharydów przeprowadzimy na drodze wgłębnej hodowli mycelialnej grzyba leczniczego Lentinula edodes, należącego do klasy Basidiomycetes, wykorzystując podłoża hodowlane wzbogacane w różne związki selenu.
- Zastosujemy (opracujemy) metodę frakcjonowania tych związków umożliwiającą izolację polisacharydów o różnej masie molowej, składzie monosacharydowym i zawartości selenu poprzez użycie do ekstrakcji eluentów o różnej polarności i charakterze chemicznym.
W części analitycznej badań:
- Zastosujemy do badań nieznanego dotąd sposobu w jaki selen jest związany ze strukturą polisacharydów metodę rentgenowskiej spektroskopii absorpcyjnej (XANES, XAFS) oraz magnetycznego rezonansu jądrowego (widma selenowe NMR)
- Przeprowadzimy dokładną analizę budowy selenopolisacharydów, poprzez wykorzystanie metod:
• do oznaczania składu monosacharydowego, po całkowitej hydrolizie, metodę wysokosprawnej chromatografii cieczowej,
• do oznaczania masy molowej izolowanych polisacharydów wykorzystamy technikę chromatografii żelowej (GPLC),
• do oznaczania struktury pierwszorzędowej, wykorzystamy metody degradacyjne, z wykorzystaniem hydrolizy enzymatycznej oraz zmodyfikowanej metody Hakomori - poprzez wstępną metylację, a następnie hydrolizę analizowanych frakcji,
• do oznaczania typu wiązań glikozydowych zastosujemy metody spektralne IR i NMR,
• do oznaczania struktury przestrzennej zastosujemy metody (2D) NMR
W części immunologicznej badań:
- Zbadamy wpływ Se-polisacharydów o zróżnicowanej masie molowej, zawartości selenu i strukturze i na proliferację limfocytów T i B krwi ludzkiej, poprzez przeprowadzenie testów OKT3, PHA i SAC
- Zbadamy czy Se-polisacharydy wykazują zdolność aktywacji makrofagów, komórek NK, oraz czy wpływają na odpowiedź zależną od limfocytów T.
Zakładamy, że wyniki zaplanowanych badań pozwolą wysunąć hipotezę dotyczącą przyczyn nietypowej dla polisacharydów pochodzenia grzybowego, stwierdzonej we wstępnych badaniach aktywności immunosupresyjnej selenowanych frakcji polisacharydowych. Zakładamy również , że uda nam się zbadać, w jakim stopniu inkorporacja selenu do cząsteczki egzopolisacharydów zmienia ich strukturę przestrzenną, co z kolei zapewne wpływa na wiązalność tych związków z receptorami CR-1 i CR-3. Wyniki badań powinny również rozszerzyć zakres wiedzy na temat metabolizmu związków selenu przez grzyby oraz możliwości biosyntezy przez nie selenopolisacharydów. Efektem badań powinny być publikacje w czasopismach z listy JCR oraz doniesienia zjazdowe. Zakładamy, że badania przyczynią się do rozwoju młodej kadry naukowej, stanowiąc przedmiot pracy/prac doktorskich. Jest również prawdopodobne zastosowanie ich wyników do zaprojektowania i otrzymywania innowacyjnego leku o działaniu immunosupresyjnym, należącego do nowej grupy chemicznej.

Celem planowanych badań jest wykrywanie obecności 13 zidentyfikowanych w genomie S. mutans UA159 (ATCC 700610) dwuskładnikowych systemów regulacyjnych (TCS) oraz zbadanie roli czterech z nich, poprzez konstrukcje delecyjnych mutantów klinicznych izolatów S. mutans, w tworzeniu płytki nazębnej u dzieci oraz dorosłych uwzględniając dwa typy zębów (stałe i mleczne). Otrzymane szczepy ze zinaktywowanymi genami kodującymi domeny sensorowe analizowane będą pod kątem wytwarzanej biomasy oraz struktury tworzonego biofilmu. W ramach niniejszego projektu planowana jest również ocena lekowrażliwości szczepów klinicznych S. mutans oraz otrzymanych mutantów na wybrane antybiotyki i chemioterapeutyki. Pobrane zostaną wymazy z powierzchni zębów dzieci oraz dorosłych i posiane na podłoże Mitis Salivarius Agar uzupełnione sacharozą, bacytracyną i tellurynem potasu, po czym inkubowane przez 48 h w temperaturze 37°C w 5% stężeniu C02. Identyfikacja obejmować będzie dwa etapy: identyfikację na podstawie cech biochemicznych oraz identyfikację genetyczną z zastosowaniem metody nested-PCR. W dalszej części projekt będzie bazował na podstawowych technikach biologii molekularnej (tj. izolacja materiału genetycznego, PCR, Multiplex PCR. analiza restrykcyjna itp.). Do identyfikacji 13 TCS posłuży metoda Multiplex PCR i/lub klasyczny PCR. Do inaktywacji genów kodujących systemy dwuskładnikowe z kolei wykorzystana zostanie metoda mutagenezy ligacyjnej. Zdolność i intensywność tworzenia biofilmu in vitro na polistyrenowych płytkach titracyjnych zarówno przez izolaty kliniczne jak i szczepy zmutowane oceniana będzie metodą barwienia fioletem krystalicznym oraz metodą barwienia MTT z wykorzystaniem spektrofotometru. Hodowla biofilmu zakładana będzie na podłożu BHI i inkubowana w temperaturze 37°C w 5% stężeniu CO., przez 24h do 48h. Z kolei struktura biofilmu badana będzie za pomocą elektronowej mikroskopii skaningowej. Ocena lekowrażliwości szczepów klinicznych S. mutans i mutantów przeprowadzona zostanie z wykorzystaniem systemu Vitek-2 Compact. S. mutans jest jednym z najważniejszych gatunków drobnoustrojów spośród mikroflory zasiedlającej jamę ustną osób dorosłych i dzieci bezpośrednio związany z powstawaniem próchnicy zębów stałych oraz mlecznych. Próchnica stanowi bardzo poważne i powszechnie występujące schorzenie o podłożu zakaźnym i mimo postępów w dziedzinach stomatologii oraz higieny, pozostaje wciąż istotnym problemem naszego społeczeństwa. Jednym z ważnych czynników wirulencji bakterii prochnicotwórczych w tym S. mutans jest zdolność do tworzenia płytki nazębnej tzw. naturalnego biofilmu. W zróżnicowanym środowisku jakim jest jama ustna bakterie żyjące w strukturze biofilmu narażone są na różnego rodzaju niekorzystne czynniki środowiskowe tj.: zmiany temperatury, warunków żywieniowych oraz natężenie tlenu. Ich zdolność do adaptacji, przetrwania oraz wywołania tak poważnej jednostki chorobowej jaką jest próchnica wskazuje na konieczność dogłębnej analizy molekularnych mechanizmów odpowiedzi bakterii żyjących w biofilmie na napotkane warunki stresowe. Jak wykazano w przypadku S. mutans odpowiedź na zmiany zachodzące w środowisku odbywa się z udziałem dwuskładnikowych systemów regulacyjnych. Dlatego dogłębne poznanie budowy i funkcjonowania TCS wydaję się niezbędne do całkowitej eliminacji bądź modyfikacji cech tego drobnoustroju tym bardziej, że badania ostatnich lat wykazały, że dwuskładnikowe systemy regulacyjne mogą stanowić nowe potencjalne miejsca działania leków.