Wykorzystanie inhibitorów mikroRNA w celu przywrócenia ekspresji supresora nowotworzenia, genu SLC5A8, i określenie możliwości ich zastosowania w terapii raka brodawkowatego tarczycy.

Cel prowadzonych badań/hipoteza badawcza: Nowotwory tarczycy stanowią najczęstszą grupę nowotworów endokrynnych, a ich liczba stale wzrasta. Najczęstszym, stanowiącym 85% ogółu, jest rak brodawkowaty tarczycy (PTC). Podstawą jego leczenia jest chirurgiczna resekcja tarczycy wraz z regionalnymi węzłami chłonnymi oraz terapia uzupełniająca polegająca na podaniu promieniotwórczego jodu 1131. Część pacjentów jest jednak oporna na terapię jodem radioaktywnym. Wobec ograniczonej skuteczności innych form leczenia, m. in. teleradioterapii, chemioterapii, chorzy ci umierają z powodu agresywnego przebiegu choroby. Stąd też konieczne jest poszukiwanie nowych terapii.
Produkt białkowy genu SLC5A8 został pierwotnie zidentyfikowany jako transporter jodkowy obecny w błonie szczytowej tyreocytów i z tego powodu nazwany AIT (ang. Apical Iodide Transporter) Jest też supresorem nowotworzenia, a jego ekspresja jest obniżona w wielu nowotworach, w tym w PTC Najwięcej badań dotyczących jego funkcji supresorowej dotyczy jelita grubego i opiera się na zdolności AIT do transportu krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych Tylko kilka prac wspomina o modulacji przez SLC5A8 innych genów zaangażowanych w proces nowotworzenia, a są to geny tak fundamentalne jak TP53, FASL, FASR, Bcl-2, TRAIL, TRAILR1 i 2, BIRC5 Zaskakujące jest zatem, że nikt nie przeprowadził zmian wywoływanych przez nadekspresję SLCSA8 na poziomie całego transkryptomu. Istnieją jedynie nieliczne badania nad regulacją ekspresji SLC5A8, co skierowało naszą uwagę na rolę mikroRNA w tym procesie MikroRNA (miRNA) to około 22 nukleotydowe niekodujące cząsteczki RNA, które hamują ekspresję genów poprzez wiązanie z komplementarną sekwencją w ich transkryptach, W wykonanych przez nas badaniach wstępnych wykazaliśmy, że miR-181a-5p, -182-5p i -494 regulują ekspresję SLC5A8, a ich podwyższony poziom w PTC może prowadzić do obniżenia ekspresji SLCSA8. Wykazaliśmy także wpływ mikroRNA na proces transportu jodu radioaktywnego. Zmiany w ekspresji mikroRNA można modulować poprzez specyficzne inhibitory, dlatego też potwierdziliśmy, że transfekcja syntetycznym inhibitorem miR-181a-5p zwiększa ekspresję mRNA SLC5A8 i postawiliśmy hipotezę, że hamując aktywność zidentyfikowanych mikroRNA spowodujemy zwiększenie ekspresji SLC5A8. co doprowadzi do zwiększonej akumulacji jodu radioaktywnego oraz do zmiany poziomu genów regulowanych przez SLC5A8, co może zwiększyć skuteczność terapii przeciwnowotworowych.
Celem projektu jest wykorzystanie specyficznych inhibitorów mikroRNA do przywrócenia właściwego poziomu SLC5A8 w komórkach wyprowadzonych z raka tarczycy. Przeprowadzimy podwójną analizę wpływu podwyższonej ekspresji SLC5A8 na fizjologię komórek: za pomocą sekwencjonowania nowej generacji określimy całkowity transkryptom linii komórkowych, w których zahamowane zostanie działanie wybranych mikroRNA (analiza potencjalnej cytotoksyczności inhibitorów). Następnie zbadamy całkowity transkryptom linii komórkowych, w których przeprowadzimy nadekspresję genu SLCSA8 (analiza roli SLC5A8 w regulacji ekspresji genów). Dzięki tej analizie zidentyfikujemy szlaki, w których SLC5A8 wywiera swoją rolę supresorową. MiR-181a-5p, -182-5p i -494-3p ulegają nadekspresji także w innych nowotworach, możemy zatem nazywać je onkomiRami. Tym bardziej uzasadnione jest zbadanie wpływu ich inhibicji na zmiany zachodzące na poziomie całego transkryptomu. Następnym krokiem będzie porównanie zmian w ekspresji genów wywołanych nadekspresją SLC5A8 oraz inhibicją mikroRNA. Nie tylko dostarczy to listy genów docelowych, ale także przybliży nas do odpowiedzi na pytanie, czy tkankowospecyficzna inhibicja tych mikroRNA mogłaby w przyszłości znaleźć zastosowanie terapeutyczne. Zastosowana metoda badawcza/metodyka: Podczas realizacji projektu stworzymy plazmid wyrażający sekwencję kodującą genu SLC5A8 oraz tzw. sponge dla miR-181a-5p, -182-5p i -494, wyrażający transkrypt o sekwencji komplementarnej do 3 mikroRNA, działający jako specyficzny inhibitor tych cząsteczek.. Optymalne warunki transfekcji określimy mierząc ekspresję SLC5A8 oraz co najmniej jednego z jego opisanych genów docelowych za pomocą PCR czasu rzeczywistego. Po określeniu optymalnego protokołu z komórek wyizolujemy RNA, przygotujemy bibliotekę cDNA i poddamy sekwencjonowaniu nowej generacji (NGS). Stworzymy listy genów o ekspresji zmienionej pod wpływem nadekspresji SLC5A8 oraz (osobno) wyciszenia mikroRNA. Następnie porównamy ze sobą te listy, celem określenia zmian wywołanych nadekspresją genu, zmian wywołanych przez wyciszenie wybranych mikroRNA, a w konsekwencji określimy potencjalną użyteczności inhibitorów mikroRNA w przywracaniu ekspresji SLC5A8 w raku PTC. Wpływ spodziewanych rezultatów na rozwój nauki, cywilizacji, społeczeństwa: Będzie to pierwszy projekt w ramach którego zostanie scharakteryzowany wpływ SLC5A8 na ekspresję innych genów na poziomie całego transkryptomu. Określimy także możliwości przywrócenia jego ekspresji za pomocą inhibicji mikroRNA. Co istotne, dzięki zastosowaniu techniki NGS wskażemy użyteczne z terapeutycznego punktu widzenia inne geny docelowe dla tych mikroRNA. Porównamy zmiany wywołane nadekspresją genu SLC5A8 z wywołanymi przez wyciszenie wybranych przez nas mikroRNA, które regulują także inne geny docelowe, w tym zaangażowane w supresję nowotworzenia. Dzięki temu określimy potencjalną użyteczność wyciszania wybranych mikroRNA u pacjentów cierpiących na raka brodawkowatego tarczycy.