Narodowe Centrum Nauki

Padaczka jest schorzeniem, którego natura jest w dalszym ciągu słabo poznana. Pomimo prowadzonych badań, ciągle nie udaje się wskazać przyczyn zwiększonej wrażliwości części osób na czynniki drgawkotwórcze a także powodów, dla których u pewnego odsetka chorych standardowa terapia przeciwpadaczkowa nie jest skuteczna. Celem naszych badań jest próba analizy podłoża indywidualnych różnic w szybkości rozwoju napadów drgawkowych, a także różnic w odpowiedzi na leki przeciwpadaczkowe. W analizie uwzględniona zostanie ocena parametrów biochemicznych (stężeń monoamin, aminokwasów hamujących i pobudzających) oraz immunocytochemicznych (ekspresji wybranych podjednostek receptorów, mediatorów reakcji zapalnej a także markerów przebudowy neuroplastycznej). Istotnym elementem będzie także analiza ekspresji białka
REST, zaangażowanego w regulację aktywności GABA-ergicznej oraz aktywności kinazy mTOR, której rola w patogenezie padaczki związanej ze stwardnieniem guzowatym jest bezdyskusyjna, jednakże w chwili obecnej postuluje się także jej możliwy udział w patogenezie padaczek nabytych. Planujemy także uwzględnić analizę skuteczności działania leków przeciwpadaczkowych w wytypowanych populacjach o różnej podatności na rozwój drgawek.

Stan wiedzy o zjawiskach towarzyszących najwcześniejszym fazom zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu C (HCV), jest wciąż niezadowalający. Wynika to z braku dobrego modelu doświadczalnego oraz specyfiki przebiegu klinicznego zakażenia, które w tej fazie jest zazwyczaj bezobjawowe. W szczególności, wciąż niepełna jest wiedza o czynnikach, które warunkują eliminację wirusa lub też jego przetrwanie i rozwój choroby. W przedstawionym Projekcie planujemy zbadanie 180 krwiodawców z nowo nabytym zakażeniem HCV.
Celem przedstawionego projektu jest zbadanie czynników oddziałujących we wczesnej fazie zakażenia, które warunkują eliminację lub przetrwanie zakażenia HCV. Analizowane będą czynniki zarówno ze strony gospodarza: aktywacja odpowiedzi układu immunologicznego i uwarunkowania genetyczne (genotyp IL28B), jak również ze strony wirusa: złożoność populacji oraz występowanie charakterystycznych motywów sekwencji HVR1 i 5’UTR HCV przy użyciu technik głębokiego sekwencjonowania.

Zespół stopy cukrzycowej (ZSC)-jest poważnym powikłaniem długo trwającej cukrzycy, pojawiającym się u ponad 15% chory cli / cukrzycą (¡łownymi czynnikami palogenclyc/nymi /SC są ncuropatia i choroby tętnic obwodowych. W zależności od dominującego czynnika etiologicznego ZSC jest podzielony na typy: neuropatyczny ZSC. naczyniowy ZSC oraz typ mieszany. Hipotezą badawczą jest istnienie zmienności w obrębie genu Osteoprotegeryny wpływającego na częstość występowania poszczególnych typów zespołu stopy cukrzycowej.
Celem badania jest ocena roli polimorfizmów OPG u pacjentów z cukrzycą typu 2 z zespołem stopy cukrzycowej o etiologii neuropatycznej, naczyniowej i mieszanej oraz z neuroartropatią Charcot.

Zespół stopy cukrzycowej (ZSC)-jest poważnym powikłaniem długo trwającej cukrzycy, pojawiającym się u ponad 15% chory cli / cukrzycą (¡łownymi czynnikami palogenclyc/nymi /SC są ncuropatia i choroby tętnic obwodowych. W zależności od dominującego czynnika etiologicznego ZSC jest podzielony na typy: neuropatyczny ZSC. naczyniowy ZSC oraz typ mieszany. Hipotezą badawczą jest istnienie zmienności w obrębie genu Osteoprotegeryny wpływającego na częstość występowania poszczególnych typów zespołu stopy cukrzycowej.
Celem badania jest ocena roli polimorfizmów OPG u pacjentów z cukrzycą typu 2 z zespołem stopy cukrzycowej o etiologii neuropatycznej, naczyniowej i mieszanej oraz z neuroartropatią Charcot.

1. Identyfikacja nowych, rzadkich i funkcjonalnych wariantów genetycznych w obrębie genów,
które związane są z procesem aktywacji i agregacji płytek krwi w populacji polskiej z wywiadem
przebytego udaru niedokrwiennego mózgu.
2. Porównane w grupie badanej oraz kontrolnej (bez wywiadu udaru niedokrwiennego mózgu)
nosicielstwa rzadkich wariantów funkcjonalnych w obrębie poszczególnych genów (o potencjalnej
szkodliwości) w celu określenia ich związku z ryzykiem wystąpienia udaru mózgu.
3. Ocena zależności pomiędzy obecnością rzadkich wariantów funkcjonalnych a krótkoterminowym
rokowaniem w oparciu o ocenę zaburzeń neurologicznych u pacjentów po udarze niedokrwiennym
mózgu.
4. Badania funkcjonalne genów oparte na wykorzystaniu hodowli komórek in vitro jako modelu
doświadczalnego w celu potwierdzenia zmian aktywności białek na poziomie komórkowym.

Hipoteza badawcza projektu zakłada, iż produkcja dwóch kluczowych mediatorów w układzie trójdzielnym - peptydu pochodnego genu kalcytoninowego (CGRP) oraz czynnika neurotroficznego pocłiodzenia mózgowego (BDNF) jest uzależniona od aktywności neuronów oraz obecności czynników zapalnych. Celem projektu jest zbadanie roli cytokiny prozapalnej - czynnika martwicy nowotworów (TNF) w modulacji funkcji neuronów czuciowych zwoju trójdzielnego.

Receptor γc (CD132) jest podjednostką wchodzącą w skład receptorów dla interleukin (IL) 2, 4, 7, 9, 15 i 21. Zbyt wysoka aktywacja γc prowadzi do nadmiernej odpowiedzi immunologicznej i może powodować rozwój chorób o podłożu autoimmunologicznym. Przyłączenie ligandu do receptora γc prowadzi do fosforylacji kinaz Janusowych JAK1 i JAK3, a następnie do przekazania sygnału do jądra komórkowego i aktywacji ekspresji genów. W ostatnich latach prowadzone są badania nad możliwością zastosowania inhibitorów kinaz JAK1 i JAK3 w terapii chorób o podłożu autoimmunologicznym. Celem badań zaplanowanych w ramach niniejszego projektu jest zbadanie, czy cefazolina, antybiotyk cefalosporynowy, hamuje aktywację receptora γc.

Celem niniejszego badania jest identyfikacja białkowych markerów prognostycznych dla płaskonabłonkowego raka sromu (RS). Komputerowa analiza zmian na poziomie szlaków regulatorowych mająca na celu modelowanie karcynogenezy może dostarczyć nowe mocne hipotezy dotyczące biologicznych przyczyn progresji RS. Zamierzamy opracować metodę ilościowej oceny ekspresji wybranego panelu białek z zastosowaniem techniki MRM (monitorowanie reakcji fragmentacji, ang. multiple reaction monitoring). Opracowany test umożliwi ilościową ocenę ekspresji badanych białek. Korelacja poziomu peptydów w guzach z danymi klinicznymi uzyskanymi z okresu obserwacji chorych pozwoli na ocenę wartości predykcyjnej testu. Metodyka badawcza zaproponowana w niniejszym wniosku może doprowadzić do detekcji wielu białek o odmiennej ekspresji w guzach uzyskanych od chorych z progresją RS („progVC”) w trakcie okresu obserwacji w porównaniu z ekspresją w guzach chorych z długim czasem przeżycia bez choroby (“d-fVC”) w czasie 8-12-letniej obserwacji. Białka te mogą być następnie pogrupowane według wspólnych cech biologicznych, co pozwoli odkryć zmiany będące przyczyną agresywnego fenotypu nowotworu.

Projekt realizowany w ramach konsorcjum naukowego Liderem projektu jest Instytut Genetyki Człowieka Polskiej Akademii Nauk natomiast Partnerami Instytut Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego Polskiej Akademii Nauk oraz Warszawski Uniwersytet Medyczny, I Wydział Lekarski.
W proponowanym projekcie zakładamy, że w nowotworach poza dobrze już udokumentowanymi uszkodzeniami genów, dochodzi również do niepoznanych jeszcze mutacji w obrębie regulomu (sekwencji niekodujących odpowiedzialnych za regulację ekspresji genów), które w znacznym stopniu przyczyniają się do patogenezy tych chorób.
Celem niniejszego projektu jest identyfikacja potencjalnych mutacji w obrębie regulomu płaskonabłonkowych raków krtani {ang. laryngeal squamous cell carcinoma - LSCC).
W niniejszym projekcie planujemy celowane sekwencjonowanie NGS regulomu, w skład którego wchodzi zdefiniowany region wielkości 46 min par zasad, pokrywający proksymalne enhancery i promotory, zidentyfikowane doświadczalnie metodami DNase l-seq i CAGE w ramach projektów ENCODE i FANTOM; zarówno konstytutywne (aktywny w wielu typach komórek) jak i specyficzne dla komórek epitelialnych. Sekwencjonowanie zostanie wykonane na platformie genomowej HiSeq 1500 (lllumina) z wykorzystaniem zestawu TruSeq SBS Kit (lllumina). Wszystkie biblioteki będą sekwencjonowanie w trybie sparowanych końców (2 x 100 pz) ze średnim pokryciem na poziomie 90x (minimalnie 20x) dla próbek referencyjnych oraz 190x (minimalnie 40x) dla nowotworowych linii komórkowych i guzów.
Materiał badany, w sumie 94 próbek, stanowić będzie 7 par: linia komórkowa LSCC - przynależna hodowla nienowotworowych fibroblastów oraz 40 par: ptaskonabłonkowy guz krtani - krew obwodowa (od tego samego pacjenta).
Równolegle zostanie przeprowadzona całogenomowa analiza ekspresji genów przy użyciu mikromacierzy w grupie 7 badanych linii komórkowych (w sumie trzykrotne powtórzenia) oraz w grupie 15 nienowotworowych próbek referencyjnych (komórki epitelialne),
Otrzymane wyniki zostaną poddane analizie bioinformatycznej, której celem będzie identyfikacja zmian somatycznych poprzez porównanie łinia komórkowa - fibroblasty, nowotwór - krew a następnie zintegrowanie zidentyfikowanych zmian z danymi ekspresyjnymi. Takie podejście pozwoli na wyłonienie mutacji w obszarach regulatorowych w sąsiedztwie genów o istotnie zmienionej ekspresji. W tym celu wykorzystana zostanie stale aktualizowaną baza danych obszarów i motywów regulatorowych (Nencki Genomics Database - NGD). Tym samym wybór najistotniejszych zmian w sekwencjach regulatorowych zostanie przeprowadzony na podstawie:
(a) wpływu znalezionych zmian na ekspresję sąsiadujących genów (porównanie ekspresji w grupach linie komórkowe - kontrolne tkanki nienowotworowe, dane mikromacierzowe),
(b) częstości występowania zmian w danej sekwencji regulatorowej (w grupie 40 nowotworów).
W ostatnim etapie prac najistotniejsze, zidentyfikowane zmiany zostaną zwalidowane innymi technikami (pirosekwencjonowanie, sekwencjonowanie Sangera, qRT-PCR) w grupie badanych linii komórkowych oraz guzów pierwotnych a także techniką Western biot na poziomie białka. Ponadto, w celu oszacowania częstości zmian zostanie przeprowadzone celowane badanie zidentyfikowanych loci powyższymi technikami w dodatkowej grupie 50 pierwotnych guzów krtani.
W literaturze na dzień dzisiejszy brak jest doniesień na temat udziału zmian w obrębie regulomu w patogenezie LSCC. Stąd planowane badania są pierwszym na skalę światową podejściem badawczym integrującym dane dotyczące obecności wariantów sekwencji regulatorowych z globalną ekspresją genów w tych nowotworach. Uważamy, że takie podejście badawcze może przyczynić się do opisania istotnych zmian w regulomie co przyczyni się do lepszego zrozumienia podstaw genetycznych patogenezy LSCC.

Projekt realizowany w ramach konsorcjum naukowego Liderem projektu jest Instytut Medycyny Doświadczalnej i Klinicznej im. Mirosława Mossakowskiego Polskiej Akademii Nauk natomiast Partnerem Warszawski Uniwersytet Medyczny, I Wydział Lekarski.
Zespół Gillesa de la Tourette'a (GTS) jest schorzeniem neuropsychiatrycznym dzieci i dorosłych o nieznanej przyczynie, którego głównymi objawami są tiki i zaburzenia psychiczne. Nasilenie tików zmniejsza się po 15 rż. Jedynie u 1/5 osób tiki utrzymują się w stopniu ciężkim w wieku dorosłym. Przyczyna ustępowania tików u niektórych tylko osób jest nieznana. Nie istnieje obecnie test diagnostyczny potwierdzający kliniczną diagnozę GTS. W patogenezie choroby główną rolę odgrywają czynniki genetyczne.. Autyzm jest wczesnodziecięcym zaburzeniem rozwojowym, które powoduje zaburzenia funkcjonowania społecznego, zaburzenia mowy i stereotypie ruchowe. U części chorych z GTS występują cechy autystyczne a oba schorzenia wykazują objawy wspólne. Podłoże biologiczne autyzmu nie jest ustalone. Celem badania jest określenie podłoża genetycznego choroby w wyselekcjonowanych trzech grupach: 1. w rodzinach z GTS o bardzo wyraźnym wywiadzie rodzinnym choroby; 2. w rodzinach, w których GTS i autyzm występuje u blisko spokrewnionych osób; oraz 3. w grupie osób dorosłych z GTS i ciężkim tikami (co może wskazywać na obecność dodatkowego czynnika genetycznego). W badaniach planujemy wykorzystać nie stosowaną dotychczas w badaniu podłoża GTS metodę analizy sekwencji całego genomu (whole genome sequencing, WGS), dzięki czemu w uzyskanych surowych wynikach sekwencjonowania możliwe będzie wyszukiwanie zmienności liczby kopii DNA (copy number variants, CNV), regionów utraty heterozygotyczności (loss of heterozygosity, LOH), rzadkich wariantów genetycznych (mutacji) oraz zidentyfikowanie mutacji sprawczych poprzez zastosowanie najnowszych algorytmów bioinformatycznych, porównywanie sekwencji genomów zdrowych i chorych członków rodziny oraz pacjentów z różnymi fenotypami klinicznymi GTS (m.in. postać ciężka GTS dorosłych vs postać łagodna dziecięca).
W badaniach zostaną wykorzystane trzy grupy: 1. osiem rodzin, z których w każdej występuje co najmniej 5 osób z rozpoznaniem GTS lub innymi tikami (badaniu poddanych zostanie 40 osób z każdej z rodzin: 3 osoby chore + 2 osoby zdrowe, najczęściej rodzice); 2. cztery rodziny z współwystępowaniem GTS oraz autyzmu (badaniu poddanych zostanie 20 osób: 4 osoby z GTS, 4 osoby z autyzmem oraz 12 zdrowych członków rodziny); oraz 3. grupa dorosłych pacjentów z GTS i ciężkim tikami (30 osób). Całkowita grupa badana obejmowała będzie 90 osób. Ponieważ populacja dzieci z GTS w Polsce sięga 60.000 osób, a dorosłych ok. 3.500 osób, liczebności grup badanych są reprezentatywne i dają szansę na określenie podłoża genetycznego choroby, zwłaszcza że grupy 1. i 2. dotyczą postaci rodzinnych, a grupa 3. ciężkiej postaci GTS. W badaniach planujemy wykorzystać nie stosowaną dotychczas w badaniach nad GTS metodę sekwencjonowania całego genomu (WGS). W uzyskanych surowych odczytach genomu wyszukiwane będą zarówno warianty ilości kopii (CNV), jak i zmiany punktowe sekwencji DNA. Otrzymana lista wariantów poddana będzie dalszej, dogłębnej analizie bioinformatycznej z zastosowaniem najnowszych algorytmów i dostępnych narzędzi. Analiza będzie miała na celu zidentyfikowanie wariantów potencjalnie sprawczych, zwłaszcza tych, które mogą wpływać na strukturę produktów białkowych.
Analiza bioinformatyczna każdorazowo obejmowała będzie porównanie genomów osób chorych i zdrowych w obrębie rodziny, osób chorych pomiędzy rodzinami oraz osób chorych z sekwencjami zgromadzonymi w publicznych bazach danych. W analizie zostanie dodatkowo wykorzystana przygotowana przez nas w ramach realizacji innego projektu baza sekwencji całego eksomu >100 osób z populacji polskiej.
Wyselekcjonowane warianty genomowe zostaną potwierdzone metodą sekwencjonowania sangerowskiego lub MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification), a ich występowanie sprawdzone będzie jak najszerzej w rodzinach probandów.
Projekt jest pierwszą w Polsce próbą poznania genetycznego podłoża GTS oraz ustalenia możliwych zależności pomiędzy genotypem a fenotypem klinicznym choroby. Unikalność badania polega na wykorzystaniu nowoczesnej metody sekwencjonowania całego genomu (WGS) i zaawansowanych metod bioinformatycznych z wykorzystaniem danych uzyskanych z jednorodnych pod względem pochodzenia etnicznego i w pełni klinicznie opisanych grupach pacjentów i osób zdrowych. W jednym badaniu analizowane będą zarówno szeroko pojęte rearanżacje genomu, jak zmiany punktowe sekwencji DNA, a zwłaszcza mutacje sprawcze. Spodziewamy się, że realizacja projektu doprowadzi do zidentyfikowania nowych genów i/lub loci związanych z GTS, określenia wspólnych genów/loci dla chorób neuropsychiatrycznych takich jak autyzm i GTS, ustalenie podłoża genetycznego warunkującego zmienny przebieg GTS, wskazania szlaków biochemicznych i/lub sygnałowych na poziomie komórkowym, a także umożliwi wyznaczenie markerów genomowych choroby a w przyszłości opracowania nowych metod leczenia GTS.