Narodowe Centrum Nauki

Bakteriofagi (fagi) są wirusami swoistymi dla komórek bakteryjnych. Jak dotąd, głównym zastosowaniem bakteriofagów w medycynie było leczenie infekcji bakteryjnych. W piśmiennictwie są jednak również dane wskazujące na możliwość hamowania przez wiriony fagowe zakażeń wirusami patogennymi. Celem projektu jest ocena wpływu wysoce bakteriofagów T4 (fag E. coli) i A5/80 (fag gronkowcowy) i ich dsDNA na główne etapy cyklu replikacyjnego ludzkiego adenowirusa typu 5 (HAdV-5), w tym adsorpcję, syntezę białek wczesnych i późnych wirusa, transport wewnątrzkomórkowy, składanie wirionów i ich uwalnianie z komórek. Planowana jest również ocena potencjalnego działania przeciwwirusowego dsDNA obu badanych bakteriofagów. Ponadto badany będzie wpływ fagów na ekspresję genów TLR (oraz białek zaangażowanych w przekazywanie sygnału z tych receptorów), jak również genów kodujących receptory HAdV (CAR, łańcuchy αv i β3 integryn) - indukcja zmian ekspresji tych genów jest bowiem kolejnym możliwym działaniem fagów, które może odpowiadać za ich aktywność przeciwwirusową. Badany będzie również wpływ obu fagów i ich dsDNA na produkcję interferonu typu I w wyniku pobudzenia tych receptorów.
OCZEKIWANE REZULTATY:
Po raz pierwszy dokładnie zbadany zostanie wpływ wysoce oczyszczonych wirionów bakteriofagowych (i ich dsDNA) na główne etapy cyklu replikacyjnego wirusa patogennego. Ponadto po raz pierwszy oceniona zostanie zdolność fagów do aktywacji receptorów TLR, i ich wpływ na ekspresję genów tych receptorów i genów kodujących receptory dla wirusa patogennego. Ze względu na to, że bakteriofagi są najliczniejszą i wybitnie zróżnicowaną grupą wirusów, wyniki projektu mogą stanowić punkt wyjścia do przyszłych rozległych badań nad interakcjami między fagami i wirusami patogennymi. Wykazanie działania przeciwwirusowego fagów mogłoby wskazywać na nową i nieoczekiwaną rolę fagów endogennych, stanowiących istotny ilościowo składnik mikroflory organizmu człowieka i różnych zwierząt, jako czynnika zaangażowanego również w odporność przeciwwirusową organizmu. Chociaż projekt ma charakter badań podstawowych i nie ma bezpośrednich zastosowań praktycznych, jego wyniki mogą w przyszłości prowadzić do zastosowania bakteriofagów jako nowych leków przeciwwirusowych.

Celem projektu jest zbadanie roli układu glutaminergicznego w leczeniu depresji - weryfikacja hipotezy, czy blokowanie receptora NMDA za pomocą magnezu, cynku lub akamprozatu nasili i przyspieszy przeciwdepresyjne działanie fluoksetyny.
Badania na zwierzętach oraz badania kliniczne coraz częściej potwierdzają udział kompleksu receptora NMDA w leczeniu depresji. Wiele badań wskazuje na blokowania receptora NMDA i powodowanie zmian adaptacyjnych przez leki przeciwdepresyjne (LPD).
Koncepcja teorii glutaminergicznej depresji wiąże się także z udziałem czynnika neurotroficznego pochodzenia mózgowego (BDNF). Z danych zawartych w aktualnym piśmiennictwie wynika, że w trakcie stosowania LPD poziom BDNF we krwi wzrasta. Wykazano, że BDNF powoduje zmniejszenie ekspresji mRNA podjednostek receptora NMDA.
Wiele danych wskazuje również na udział procesów zapalnych w patogenezie i procesie leczenia depresji. Pod wpływem LPD zaobserwowano obniżenie stężenia cytokin prozapalnych, a w szczególności IL-6.
W badaniach prowadzonych na modelu zwierzęcym w Instytucie Farmakologii PAN w Krakowie wykazano, że magnez, cynk i akamprozat, poprzez modulację układu glutaminergicznego, mogą wykazywać działanie przeciwdepresyjne. Dane zawarte w piśmiennictwie dotyczą badań wykonywanych głównie na zwierzętach, prace kliniczne są nieliczne - dotyczą prób suplementacji terapii LPD jonami cynku i magnezu, brak jest prac dotyczących potencjalizacji LPD akamprozatem. Metoda badawcza
Surowica pobierana będzie od pacjentów, u których zdiagnozowano epizod depresyjny w przebiegu zaburzeń depresyjnych nawracających wg ICD- 10 lub dużą depresję wg DSM-IV. Efekt blokowania receptora NMDA oceniany będzie w trzech grupach badanych: I - fluoksetyna + magnez; II - (Ą O fluoksetyna + cynk; 111 - fluoksetyna + akamprozat. Kontrolę stanowić będzie grupa otrzymująca fluoksetynę + placebo. Surowica pobierana będzie w 6 punktach czasowych, czas trwania badania wynosić będzie 8 tygodni.
Wpływ blokowania receptora NMDA oceniany będzie poprzez badanie:
neurofizjologiczne-ocena zmian w zapisie farmakoelektroencefalograficznym (metoda opracowana
w Katedrze i Klinice Psychiatrycznej WUM);
markerów odpowiedzi terapeutycznej: stężenie BDNF oraz IL-6
stężenia fluoksetyny, magnezu, cynku i akamprozatu
stanu psychicznego: w każdym punkcie czasowym będzie przeprowadzona ocena stanu klinicznego przy zastosowaniu skal: Skali Depresji Hamiltona, Skali Lęku Hamiltona, Skali Ogólnego Wrażenia Klinicznego oraz Skali Objawów Niepożądanych.

Rezultatem projektu będzie opracowanie mechanizm działania antagonistów receptora NMDA w leczeniu depresji jest wciąż niewyjaśniony. Poza nielicznymi pracami klinicznymi, dotychczasowe prace przedstawiają głównie wyniki doświadczeń prowadzonych na zwierzętach. Planowane jest przedstawienie wyników w formie publikacji, dwóch prac doktorskich i pracy habilitacyjnej.

Hymenolepis diminuta jest najważniejszym gatunkiem modelowym wykorzystywanym w badaniu wielu aspektów inwazji tasiemców i interakcji pasożyt-żywiciel. Analiza skomplikowanych relacji pasożyt-żywiciel, adaptacji i ewolucji tasiemców wymaga poznania dokładnych podstaw molekularnych kierujących tymi procesami. W związku z tym poznanie genomu diminuta, przyczyni się do lepszego zrozumienia mechanizmów zapewniających tasiemcom sukces ewolucyjny i przetrwanie. Wyniki te zostaną porównane z dostępnymi od niedawna genomami patogenicznych gatunków z rodziny Tacniidac (Echinococcus granulosus, E. multilocutlaris, Taenia sol i um). Pozwoli to na zrozumienie mechanizmów odpowiedzialnych za zróżnicowaną patogeniczność tasiemców. Dodatkowym celem projektu będzie porównanie szczepu wsobnego U. diminuta (hodowla wsobna od ponad 100 pokoleń) ze szczepem dzikim wyizolowanym od szczura oraz człowieka i prześledzenie zmian w genomie jakie zaszły w tym czasie w izolowanej populacji tasiemca w porównaniu ze szczepami dzikimi (ludzkim i zwierzęcym). Może to mieć kluczowe znaczenie w poznawaniu procesu specjacji w populacjach izolowanych, co czyni te badania unikalnymi w skali światowej.

Cel i oczekiwane rezultaty:
Celem projektu jest poszukiwanie, wśród roślin z rodziny Oleaceae, związków o potencjalnej aktywności sprzyjającej wygaszeniu stanu zapalnego poprzez zahamowanie infiltracji neutrofili, zahamowanie produkcji cytokin prozapalnych, pobudzenie fagocytozy apoptotycznych neutrofili oraz indukcję wydzielania czynników przeciwzapalnych przez makrofagi. Dobrze udokumentowane tradycyjne zastosowanie roślin z rodziny Oleaceae w terapii chorób o podłożu zapalnym zestawione z ich fotochemiczną różnorodnością pozwala na postawienie hipotezy, że rośliny te mogą być bogatym źródłem nowych interesujących związków o wielokierunkowym działaniu przeciwzapalnym.
W celu zweryfikowania postawionej hipotezy zostaną przeprowadzone kompleksowe badania fotochemiczne połączone z izolacją aktywnych biologicznie związków. Wnikliwa charakterystyka aktywności biologicznej wyizolowanych związków in vitro i in vivo pozwoli ustalić na poziomie molekularnym ich mechanizm działania przeciwzapalnego.
Metoda badawcza
Planowane badania będą dotyczyły 32 wyciągów (wodny, 60% etanolowy, dichlorometanowy (DCM)) otrzymanych z różnych części roślin należących trzech rodzajów z rodziny Oleaceae: Fraxinus (1 gatunek), Syringa (1 gatunek) i Forsythia (3 gatunki). Plan prac został podzielony na dwie części: badania fotochemiczne i badania biologiczne.
Głównym zadaniem części fitochemicznej będzie analiza otrzymanych wyciągów i frakcji metodą HPLC- DAD-MS/MS. Najaktywniejsze wyciągi zostaną podzielone na frakcje o różnej polarności. Z najbardziej aktywnych wyciągów/frakcji, związki odpowiedzialne za zaobserwowaną aktywność zostaną wyizolowane z użyciem metody ‘bio-guided isolation’.
Badania aktywności biologicznej będą składały się z następujących etapów:
- Wstępna ocena aktywności przeciwzapalnej wyciągów zostanie ustalona w oparciu o zbadanie inhibicji wybuchu tlenowego, uwalniania proteaz (elastaza i MMP-9) i cytokin (IL-8 and ILip) na modelu ludzkich neutrofili a także wpływ na produkcję cytokin prozapalnych (IL-6 and TNF-a) i przeciwzapalnej IL-10 oraz fagocytozę apoptotycznych neutrofili przez makrofagi otrzymane z linii komórkowej THP-1. Ocena cytotoksyczności wyciągów na obydwóch modelach komórkowych.
- Dla wybranych wyciągów/frakcji wyróżniających się aktywnością zostaną przeprowadzone badania z użyciem szerszego zakresu stężeń. Dodatkowo oznaczony zostanie wpływ na powierzchniową ekspresję cząsteczek adhezyjnych oraz apoptozę neutrofili. Bardziej wnikliwe badania wpływu na produkcję czynników przeciwzapalnych (TGF-P ) oraz efferocytozę i fagocytozę zostaną przeprowadzone na makrofagach otrzymanych z linii komórkowej THP-1.
- Dla przeprowadzenia ‘bio-guided isolation’ dla każdej frakcji zostanie dobrany indywidualnie model, na którym w poprzednich etapach obserwowana była najsilniejsza lub wyróżniająca się aktywność.
- Wyizolowane aktywne związki zostaną kompleksowo zbadane na pozostałych modelach, co pozwoli wskazać na ich selektywność lub efekt plejotropowy.
- Molekularny mechanizm działania wybranych pojedynczych aktywnych związków zostanie określony poprzez wpływ na szlak NFKB, JAK/STAT, MAPK/ERK i IP3 oraz ekspresję mRNA kodującego oznaczane wcześniej cytokiny (RT-PCR, qRT-PCR)
- Dla wybranych obiecujących związków (1-3) zostanie zbadany wpływ na stan aktywacji układu immunologicznego wywołany nadciśnieniem tętniczym w zwierzęcym modelu doświadczalnym
Wpływ rezultatów
Wyciągi roślinne zawierające metabolity wtórne będące grupą związków o bardzo różnorodnej budowie chemicznej a za tym generujące dużą ilość farmakoforów o niepowtarzalnej strukturze przestrzennej od dawna były źródłem nowych leków. Dodatkowo związki pochodzenia naturalnego, w odróżnieniu od cząsteczek syntetycznych, ze względu na swoje funkcje biochemiczne w roślinie dają duże szanse na potencjalną interakcje z białkami oraz na zdolność przenikania międzykomórkowego. Obecnie ze względu na gwałtowny rozwój metod fitochemicznych, metabolomiki, modeli biologicznych oraz zracjonalizowaniu selekcji materiału roślinnego, odnotowuje się renesans zainteresowania źródłem naturalnym w poszukiwaniu nowych leków. Niniejszy projekt wpisuje się w trend nowoczesnej farmakognozji/ farmacji i pozwoli na wytypowanie związków o działaniu selektywnym lub plejotropowym mogących zmniejszać objawy chronicznego stanu zapalnego.

Komórki nabłonkowe jelita stanowią pojedynczą warstwę nabłonka, która formuje barierę oddzielającą zawartość światła jelita od komórek immunokompetentnych układu GALT Nabłonek jelitowy jest obecnie uważany za ważną część układu immunologicznego jelita niezbędną w indukcji i regulacji zarówno nieswoistych, jak i swoistych odpowiedzi immunologicznych w błonie śluzowej jelita. Zaburzenia funkcji immunologicznych komórek nabłonkowych mogą przyczyniać się do rozwoju nieswoistych zapaleń jelita (NZJ) oraz alergii pokarmowych. Głównym celem projektu jest ocena oddziaływań bakteriofagów (wirusów bakteryjnych) na funkcje immunologiczne nabłonka jelitowego in vitro.
Zastosowana metoda badawcza/metodyka
Wszystkie doświadczenia będą przeprowadzone na linii komórkowej Caco-2. W pierwszym etapie badania oceniony będzie wpływ bakteriofagów na ekspresję wybranych genów ważnych dla funkcji immunologicznych nabłonka jelitowego. Ekspresja genów oceniana będzie przy użyciu zestawu RT2 Profiler PCR Assay. Istotne indukowane przez bakteriofagi zmiany w ekspresji genów będą weryfikowane przez zmierzenie produkcji odpowiednich białek metodą ELISA (dla białek rozpuszczalnych) lub cytometrią przepływową (dla białek błonowych).
Wpływ spodziewanych rezultatów na rozwój nauki, cywilizacji, społeczeństwa
Zgodnie z nasza wiedzą, jest to pierwsze badanie oceniające wpływ bakteriofagów na funkcje immunologiczne nabłonka jelitowego. Realizacja projektu poszerzy wiedzę o roli mikroflory jelitowej w regulacji homeostazy immunologicznej w błonie śluzowej jelita oraz patogenezy NZJ i alergii pokarmowych.

Badania obecnie prowadzone przez wnioskodawcę polegają na ocenie możliwości różnicowania się niehemalopoetycznych komórek macierzystych pozyskanych z mysiego szpiku kostnego (Sca-1+ CD45- CXCR4+ SSEA1+) w komórki macierzyste płuc - pncumocyty II rzędu (AT2, ang. alveolar typc II). Udowodniono już możliwość takiego różnicowania (Kassmeret al., 2013), jednakże w chwili obecnej badania są prowadzone na modelu indukowanego uszkodzenia płuc. Modelem zwierzęcym są podwójnie transgeniczne myszy SPC-KO/SPC-TK pozbawione ekspresji białka SPC (ang. surfactant protein C) (SPC-KO) oraz zawierające gen indukujący apoplozę związane z promotorem genu SPC (SPC-TK).
Celem działania przewidzianego do realizacji jest ocena fizjologicznej zdolności do proliferacji i samo odnawiania pneumocytów II rzędu oraz oskrzelowo-pęcherzykowych komórek macierzystych (BASC, ang. bronchioalveolar slem celi) powstałych w odpowiedzi na uszkodzenie płuc. Aby zrealizować zamierzony cel wnioskodawca wyizoluje komórki AT2 oraz BASC z odpowiednio przygotowanych płuc pochodzących z dwóch grup myszy SPC-KO SPC-TK. (grupa eksperymentalna poddana indukowanemu przy użyciu gancyklowiru i bleomycyny uszkodzeniu płuc, m=10; grupa kontrolna ze zdrowymi płucami, n=10). Z obu linii komórkowych zostaną założone hodowle organoidów, które po 16 dniach zostaną zebrane, a następnie część zostanie utrwalona w postaci preparatów mikroskopowych, a druga część po dezintegracji trójwymiarowej struktury organoidów, zostanie poddana analizie cytometrycznej w celu analizy ilościowej i jakościowej. Wyniki tych analiz zostaną zestawione pomiędzy grupami oraz zostaną poddane analizie statystycznej. Do przewidzianych badań został zaplanowany ten konkretny model zwierzęcy z uwagi na fakt, że brak białka SPC będącego jednym z głównych składników surfaktantu jest przyczyną wielu schorzeń u ludzi (Hong et al., 2017). Ponadto, użycie myszy SPC-KO/SPC-TK umożliwia „celowaną częściowo dcplccję” pneumocytów II rzędu przy użyciu gancyklowiru.
Podjęta tematyka w sposób istotny dotyka problemu regeneracji płuc koniecznych w różnego rodzaju stanach patologicznych. Pncumocyty II rzędu, jak również oskrzelowo-pęcherzykowe komórki macierzyste płuc stanowią bardzo mało liczne populacje komórek płuc, które bezpośrednio odpowiedzialne są za regenerację tego narządu. Komórki AT2 oraz BASC są wrażliwe na uszkodzenia, co jest powodem powolnej i często niewystarczającej regeneracji płuc. W związku z tym pojawia się konieczność opracowania skutecznej metodyki ich izolacji z uszkodzonych płuc, namnażania i ich różnicowania pozaustrojowego, a następnie wszczepienia do uszkodzonego narządu. Wyniki otrzymane w rezultacie realizacji zaplanowanych badań wstępnych staną się istotnym przyczynkiem do podjęcia znacznie szerszego projektu, który będzie kontynuacją podjętego tematu.
Jak donosi piśmiennictwo, potencjał prolifcracyjny oraz zdolności komórek macierzystych do różnicowania się w komórki innego typu znacznie rośnie w narządach uszkodzonych. Planowane badania zakładają, żc zarówno pneumocyty II rzędu, jak i oskrzelowo-pęcherzykowe komórki macierzyste wyizolowane z uszkodzonych płuc myszy SPC-KO. SPC-TK będą znacznie aktywniejsze, co przełoży się na zwiększoną ilość wyhodowanych organoidów w grupie eksperymentalnej. Organoidy tc, charakteryzować się powinny wyższą ogólną liczbą komórek niż w grupie kontrolnej. W zależności od tego, z której linii komórkowej powstaną, powinny zawierać wyższy odsetek samo odnowionych komórek macierzystych (w przypadku linii komórkowej AT2), a w przypadku linii komórkowej BASC wyższy odsetek zarówno samo odnowionych komórek BASC, jak również pneumocytów II rzędu.
Wyniki tc mogłyby potwierdzić hipotezę, żc uszkodzenie płuc jest stymulatorem pnemocytów II rzędu oraz oskrzelowo-pęcherzykowych komórek macierzystych do zwiększenia ich fizjologicznej zdolności proliferacji i samo odnawiania. Otrzymanie wyników potwierdzających tę hipotezę bezpośrednio przyczyni się do podjęcia próby pozaustrojowego namnażania komórek macierzystych płuc, mogących w przyszłości być wykorzystywane do zwiększenia potencjału regeneracyjnego tego narządu.

Zakażenie wirusem zapalenia wątroby typu C (HCV), wywołujące wirusowe zapalenie wątroby typu C (wzw C), dotyczy ok. 170 mln osób na świecie. Stanowi ono ważny problem medyczny, gdyż może prowadzić do poważnych następstw, takich jak niewydolność wątroby oraz rak wątrobowo-komórkowy. Skryty przebieg zakażenia, ograniczony dostęp do nowoczesnego leczenia, jak i brak szczepionki są powodem ciągłego rozprzestrzeniania wirusa na świecie. Ponadto, coraz częściej obserwowane jest jednoczesne zakażenie ludzkim wirusem niedoboru odporności (HIV-1) i HCV, co pogarsza przeżywalność pacjentów oraz skuteczność leczenia przeciwwiwirusowego HCV.
Nabyta odpowiedź odpornościowa związana z aktywnością komórek T cytotoksycznych odgrywa bardzo ważną rolę dla następstw zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu C (HCV). Około 20-50% zakażonych, dzięki silnej, wielospecyficznej odpowiedzi tych komórek, spontanicznie eliminuje zakażenie. Przeciwnie, w przewlekłym wzw C wykazano występowanie słabej odpowiedzi komórek T względem wirusa, polegającej na ich funkcjonalnym „wyczerpaniu”. Obserwuje się bowiem pogorszenie wydzielania czynników zapalnych (IFN-γ, TNF-α i IL-2), zdolności niszczenia zakażonych komórek oraz możliwości namnażania komórek T po rozpoznaniu wirusa. Zaburzenia te, wywołane przewlekłym pobudzeniem układu immunologicznego, postępują w miarę trwania zakażenia i charakteryzują się nadmiarem specyficznych receptorów PD-1 i Tim-3 na powierzchni komórek T, w tym specyficznych dla HCV, które „hamują”: zdolność do namnażania, niszczenia zakażonych komórek oraz wydzielanie czynników zapalnych. Co więcej, następuje zwiększone wydzielanie cytokin przeciwzapalnych (głównie IL-10).
Jak dotychczas, badania nad „wyczerpaniem” komórek T w zakażeniu HCV opierały się na określeniu mechanizmów, stopnia odwracalności oraz wpływu tego zjawiska na rozwój zakażenia przewlekłego, podczas gdy brak danych o innych następstwach. Zwłaszcza, czy istnieje związek między „wyczerpaniem” komórek T a poziomem różnorodności immunogennych fragmentów białek (epitopów) wirusa rozpoznawanych przez te komórki. Ponadto, jak leczenie przeciwwirusowe w kierunku zakażenia HCV modyfikuje „wyczerpanie” komórek T.
Celem przedstawionego projektu jest określenie:
1. związku między „wyczerpaniem” komórek T a stopniem różnorodności immunogennych fragmentów białek wirusa zapalenia wątroby typu C rozpoznawanych przez komórki T u pacjentów z zakażeniem HCV oraz ze współzakażeniem HIV-1/HCV;
2. jak leczenie przewlekłego wirusowego zapalenia wątroby typu C wpływa na stopień „wyczerpania” komórek T u pacjentów z zakażeniem HCV oraz ze współzakażeniem HIV-1/HCV.

Wyniki badania przeprowadzonego na dużej grupie chorych pozwolą po raz pierwszy na jednoznaczne wskazanie SNP związanych z predyspozycją do rozwoju GD w populacji polskiej z OR oraz porównanie otrzymanych wyników z rezultatami badań w innych populacjach (brytyjska, chińska), zidentyfikowanie SNP związanych z występowaniem specyficznych, dobrze scharakteryzowanych fenotypów GD .

Zwiększona anizocytoza erytrocytów wyrażona parametrem: rozkładem wielkości krwinek czerwonych RDW (ang. red blood celldistribution width) jest związana z podwyższonym ryzykiem wystąpienia zawału mięśnia sercowego i udaru mózgu. Stanowi również niekorzystny czynnik prognostyczny po udarze mózgu, zawale mięśnia sercowego, u chorych z cukrzycą czy przewlekłym niedokrwieniem kończyn dolnych. Celem projektu jest określenie czy heterogenność erytrocytów jest jedynie nowym wskaźnikiem miażdżycy i czynnikiem prognostycznym wystąpienia jej powikłań, czy też jest nowym czynnikiem sprawczym przebudowy ściany naczynia. Celem badania jest również określenie mechanizmów, za pośrednictwem których anizocytoza erytrocytów wpływa na rozwój miażdżycy. Realizacja projektu pozwoli na identyfikację nowych wskaźników, które mogą być wykorzystane w przyszłości do oceny ryzyka miażdżycy. Umożliwi również opracowanie potencjalnych, nowych metod terapeutycznych.
Większość naukowców postrzega występowanie zjawiska anizocytozy, związanego z uogólnionym stanem zapalnym, jako czynnik prognostyczny wymienionych stanów patologicznych.
Naszą hipotezą jest twierdzenie, że zjawisko anizocytozy jest czynnikiem predykcyjnym dla wspomnianych dysfunkcji sercowo-naczyniowych. W ramach projektu zostanie sprawdzona jej słuszność.