Narodowe Centrum Nauki

Gruczolaki przysadki (pituitary adenomas) są guzami powstającymi z przedniego płata przysadki, która pełni funkcję centralnego regulatora hormonalnej homeostazy w organizmie. Guzy przysadki stanowią 10-15% wszystkich nowotworów wewnątrzczaszkowych, spośród których zdecydowana większość to gruczolaki. Zazwyczaj są zmianami łagodnymi, ale mogą zdarzać się również formy złośliwe, ze złą prognozą, w których wczesna detekcja nowotworu i wdrożenie leczenia neurochirurgicznego znacząco poprawia rokowanie. Do chwili obecnej, nie ma dobrego biomarkera dla złośliwych gruczolaków przysadki [1,2,6].
MicroRNA są małymi, niekodującymi cząsteczkami RNA, które mogą wpływać na regulację genów. W literaturze potwierdzono zmiany ekspresji microRNA w różnych typach nowotworów [4,5]. Najnowsze badania sugerują, deregulację microRNA również w patogenezie gruczolaków przysadki [3].
Obecny projekt zakłada identyfikację nowych cząsteczek microRNA, które mogłyby w przyszłości posłużyć jako nowy marker inwazyjności gruczolaków przysadki, przy użyciu Sekwencjonowania Nowej Generacji (NGS, Next Generation Sequencing). Kolejnym celem niniejszego projektu jest zbadanie regulacyjnej roli wybranych microRNA mających miejsce wiązania w odcinkach 3’ UTR genów dla białek cyklu komórkowego. Do dziś, niewiele wiadomo na temat regulacyjnej roli wybranych w projekcie microRNA oraz ich wpływu na poziom ekspresji białek cyklu komórkowego w gruczolakach przysadki. Warto zaznaczyć, że zwiększona ekspresja cyklin będące przedmiotem badań niniejszego projektu, często korelowana jest ze zwiększoną złośliwością nowotworów, inwazyjnością i tworzeniem przerzutów w wielu nowotworach[7].
Podsumowując, powyższy projekt zakłada zbadanie wpływu epigenetycznych czynników na ekspresję
białek cyklu komórkowego oraz potencjał inwazyjności in vitro w modelowych liniach komórkowych gruczolaków przysadki. Jednocześnie, celem przeprowadzonych badań jest znalezienie nowych genów microRNA, których zmianę ekspresji udało się potwierdzić we wstępnie przeprowadzonych badaniach.
Wyniki eksperymentów zawartych w projekcie będą miały dużą wartość poznawczą, gdyż mogą pomóc w rozumieniu wciąż niewyjaśniony wpływu microRNA na ekspresję białek cyklu komórkowego w ludzkich gruczolakach przysadki. Dodatkowo, realizacja niniejszych badań może pomóc w odkryciu zupełnie nowych zaburzeń komórkowych prowadzących do zahamowania lub progresji komórek nowotworowych, a w konsekwencji wyznaczyć kierunek poszukiwań nowych celów terapeutycznym w leczeniu ludzkich gruczolaków przysadki.

Wyniki wysokoprzepustowego sekwencjonowania DNA uzyskane od pacjentów z dziedzicznymi chorobami siatkówki ujawniły ogromną liczbę wariantów genetycznych o nieznanym znaczeniu klinicznym. Pilna potrzeba dalszych badań molekularnych mających na celu weryfikację patogenności tych wariantów, krzyżuje się z brakiem dostępu do siatkówki, części oka bezpośrednio dotkniętej chorobą. W związku z nowymi odkryciami wskazującymi na ekspresję genów ludzkiej siatkówki również w skórze, uważamy, że komórki skóry mogą stanowić dobry model do badania przetwarzania zmutowanych genów odpowiedzialnych za rozwój dystrofii siatkówki. W niniejszej pracy zamierzamy swą uwagę skupić na genie ABCA4, który jest jednym z głównych genów siatkówki i odpowiada za patomechanizm wielu jej chorób dziedzicznych. Naszym głównym celem jest określenie składu transkryptów ABCA4 i zbadanie ekspresji tego genu na poziomie mRNA i białka w mieszkach włosowych, keratynocytach i fibroblastach. Na potrzeby realizacji tego zadania z pobranych biopsji skóry zostaną założone pierwotne hodowle keratynocytów i fibroblastów. Naszym kolejnym celem będzie porównanie danych eksperymentalnych, aby wybrać i wdrożyć najbardziej odpowiedni typ komórek do badania metabolizmu zmutowanego genu ABCA4 u pacjentów.
W celu realizacji przedstawionych celów zostanie przeprowadzona analiza jakościowa transkryptów z zastosowaniem techniki szybkiej amplifikacji końców cDNA (RACE) oraz sekwencjonowania cDNA. Ilościowa ekspresja genu ABCA4 na poziomie mRNA i białka zostanie zmierzona z użyciem odpowiednio metody PCR w czasie rzeczywistym oraz metody Western Blot.
Spodziewanym efektem niniejszej pracy będzie analiza wpływu mutacji ABCA4 na proces jego przetwarzania i weryfikacja patogenności tych zmian w środowisku wewnątrzkomórkowym. Ponadto po raz pierwszy zostaną zidentyfikowane sekwencje transkryptów ABCA4 w różnych typach komórek skóry. Jesteśmy przekonani, że model zaproponowany w tych badaniach zostanie z powodzeniem wdrożony do analizy mutacji także innych genów siatkówki zaangażowanych w rozwój szerokiego spektrum dystrofii tylnej części oka i może stanowić punkt wyjścia do dalszych badań mających na celu odkrycie roli ABCA4 w skórze.

Według Światowej Organizacji Zdrowia (WHO), nowotwory złośliwe są najczęstszą przyczyną śmierci na całym świecie, powodując około 8,2 mln zgonów rocznie. Każdego roku diagnozuje się około 14 milionów nowych przypadków nowotworów złośliwych. Według najnowszych sprawozdań Międzynarodowej Agencji Badań nad Rakiem (IARC) oczekuje się, że roczna liczba przypadków nowotworów złośliwych wzrośnie z 14 milionów w 2012 roku do 22 milionów w ciągu dwóch następnych dziesięcioleci.
W Polsce nowotwory złośliwe są drugą pod względem częstości przyczyną śmierci, po chorobach układu krążenia. Podczas gdy śmiertelność z powodu chorób układu krążenia spadła znacznie w ostatnich latach, śmiertelność w wyniku nowotworów znacząco wzrosła. Rzeczywiście, umieralność z powodu nowotworów w 2008 była w Polsce wyższa niż w roku 1980, stanowiąc 25,8% wszystkich zgonów, natomiast śmiertelność z powodu chorób układu krążenia w 2008 roku była niższa o około 39% porównaniu z rokiem 1980. Istotnym faktem jest to, że zarówno zachorowalność, jak i śmiertelność z powodu nowotworów w Polsce plasują się na jednym z najwyższych poziomów wśród wszystkich krajów UE. Według najnowszego raportu z Krajowego Rejestru Nowotworów, w roku 2012 stwierdzono ponad 152 000 nowo zdiagnozowanych osób z nowotworami złośliwymi i ponad 94 000 zgonów związanych z tymi chorobami. Klasyczne formy terapii takie jak chirurgia, chemioterapia i radioterapia, są w obecnej chwili tylko częściowo skuteczne w walce z nowotworami. Pomimo licznych osiągnięć w dziedzinie genetyki i biologii molekularnej, wirusologii, chemii oraz farmakologii, nowotwory nadal skutecznie unikają leczenia. Jednakże dzięki rosnącej innowacyjności, odkryciom naukowym i postępowi technologicznemu, rozumienie choroby nowotworowej ulega głębokiej przemianie. Chociaż jeszcze w początkowym stadium, tak zwana medycyna spersonalizowana staje się nowym paradygmatem w leczeniu nowotworów. Częścią tego nowego paradygmatu jest zrozumienie nowotworu jako choroby układowej, w której zachodzi intensywny dialog między nowotworem a gospodarzem, a zwłaszcza układem odpornościowym gospodarza. Należy zwrócić uwagę, że w świetle obecnego stanu wiedzy, zdolność swoistego rozpoznawania cząsteczek związanych z nowotworem przez układ odpornościowy człowieka, czyni go narzędziem niezwykle precyzyjnym i wysoce odpowiednim dla personalizacji zabiegów przeciwnowotworowych. Dotyczy to w szczególności nowotworów związanych z zakażeniami przez takie wirusy jak HCV, HBV lub HPV, które według WHO są odpowiedzialne za prawie 20% zgonów w wyniku nowotworów w krajach o niskim i średnim dochodzie. Science Magazine nazwał immunoterapię raka "Przełomem roku 2013". Rzeczywiście, immunoonkologia jest obecnie jednym z najbardziej energicznie rozwijających się obszarów badań nad chorobami nowotworowymi i budzi wielkie nadzieje na znalezienie lekarstwa na te wyniszczające choroby. Przewiduje się, że w następnej dekadzie, immunoterapie będą podstawą leczenia w 60% typów nowotworów. Zanim jednak układ odpornościowy może zostać w pełni skutecznie wykorzystany w walce z rakiem, należy poradzić sobie z kilkoma wyzwaniami. Wyzwania te można podzielić na dwa główne obszary: 1. zrozumienie mechanizmów ucieczki nowotworu przed układem odpornościowym; 2. identyfikacja najbardziej skutecznych narzędzi przeciwnowotworowych wywodzących się z układu odpornościowego.
Wiele dowodów wskazuje na to, że nowotwory wykorzystują co najmniej kilka różnych mechanizmów, aby uniknąć kontrolowania przez układ odpornościowy. Jeden z tych mechanizmów opiera się na wzroście warunków stresu oksydacyjnego oraz wysokim poziomie reaktywnych form tlenu (ROS), takich jak nadtlenek wodoru, w obrębie masy guza. Kolejnym istotnym elementem są warunki obniżonej dostępności tlenu panujące w środowisku nowotworu zwane hipoksją. W takich warunkach następuje wyłączanie licznych mechanizmów przeciwnowotworowych w komórkach układu odpornościowego. Dlatego też ważnym staje się zrozumienie, jak komórki układu odpornościowego mogą dostosować się do tak wrogiego środowiska. Jest to jeden z celów niniejszego wniosku.
Komórki naturalni zabójcy (NK) są częścią ludzkiego układu odpornościowego i działają na pograniczu pomiędzy odpornością wrodzoną a nabytą. Liczne publikacje sugerują, że prawidłowe funkcjonowanie komórek NK odgrywa ważną rolę w walce przeciw zakażeniom wirusowym i nowotworom. W związku z tym, obecnie prowadzone są intensywne badania, aby te komórki z powodzeniem wykorzystać jako narzędzie terapeutyczne w walce z nowotworami. Niestety, przeciwnowotworowa aktywność komórek NK może być tłumiona przez wysoki poziom stresu oksydacyjnego lub hipoksyjne środowisko guza, co z kolei może poważnie utrudniać ich zastosowanie w onkologii. Z tego powodu, w naszym projekcie staramy się zrozumieć szczegółowo mechanizmy, które zachodzą w komórkach NK w warunkach stresu oksydacyjnego i hipoksji. Na tej podstawie chcemy wytypować mechanizmy, które mogą potencjalnie chronić komórki NK przed hamującym wpływem stresu oksydacyjnego i hipoksji. W finalnym etapie projektu zamierzamy stworzyć komórki NK, które będą w stanie przezwyciężyć wpływ hamującego środowiska nowotworu i skutecznie zabijać komórki nowotworowe.
W niniejszym projekcie wykorzystamy nowoczesną technikę sekwencjonowania RNA, w celu wychwycenia zmian zachodzących w komórkach NK poddanych działaniu stresu oksydacyjnego i hipoksji. Przeprowadzone badania dostarczą nam szerokiej gamy informacji na temat zmian ekspresji genów w komórkach NK w warunkach, które towarzyszą nowotworom. Spośród tej gamy dostępnych informacji wybierzemy te, które będą miały znaczenie dla zwalczania komórek nowotworowych przez komórki NK. W oparciu o zdobytą wiedzę zmodyfikujemy komórki NK, w taki sposób, żeby mogły skutecznie rozpoznawać i zabijać komórki nowotworowe w nieprzyjaznych warunkach stresu oksydacyjnego i hipoksji.
Decydując się na tak ambitny projekt chcemy przyczynić się do zidentyfikowania i zrozumienia molekularnych mechanizmów regulujących aktywność komórek NK w środowisku nowotworu, a następnie zdobytą wiedzę wykorzystać do stworzenia komórek NK, odpornych na hamujące działanie nowotworów. Zdobywa przez nas wiedza może w przyszłości doprowadzić do ulepszenia metod leczniczych, wykorzystujących modyfikowane komórki NK jako terapię przeciw nowotworom. Terapia ta może znaleźć zastosowanie także w innych chorobach człowieka.

Hipoteza: Coraz więcej danych wskazuje, że zaburzenie równowagi redoks selektywnie niszczy komórki nowotworowe, a niektóre enzymy antyoksydacyjne są ważnymi celami terapeutycznymi. Tioredoksyny (TXN), oraz należące do tej samej rodziny białek peroksyredoksyny (PRDX), są enzymami antyoksydacyjnymi, zapewniającymi utrzymanie równowagi redoks. Nasze badania wstępne wykazały znacznie podwyższony poziom reaktywnych form tlenu w komórkach ostrej białaczki limfoblastycznej B komórkowej (B-ALL). Ponadto, zarówno w liniach komórkowych B-ALL, jak i w limfoblastach pacjentów, zaobserwowaliśmy podwyższony poziom ekspresji enzymów antyoksydacyjnych z rodziny TXN. Poziom ekspresji tych enzymów wzrastał u pacjentów na etapie wznowy. Co więcej, w liniach B-ALL zaobserwowaliśmy, że PRDX1 wspomaga proliferację komórek białaczkowych. Przypuszczamy, że enzymy z rodziny TXN są jednym z czynników poprawiających przeżycie komórek białaczkowych w warunkach stresu oksydacyjnego i mogą być nowymi celami terapeutycznymi.
Cel badań: W niniejszym projekcie zbadamy skuteczność nowej, pro-oksydacyjnej strategii w leczeniu B-ALL. Najważniejszym celem projektu jest walidacja PRDX1 i innych enzymów z rodziny TXN jako potencjalnych, nowych celów terapeutycznych w B-ALL. Planujemy również zbadać, w jaki sposób PRDX1 wspomaga proliferację i przeżycie komórek B-ALL. Ponadto, chcielibyśmy ocenić, czy inhibitory enzymów z rodziny TXN uwrażliwiają komórki B-ALL na chemioterapeutyki stosowane w leczeniu B-ALL.
Metoda badawcza: Aby osiągnąć powyższe cele, planujemy zastosować kilka modeli badawczych: linie komórkowe B-ALL (NAM-6 i SEMK2), materiał kliniczny pobrany od pacjentów B-ALL (limfoblasty izolowane ze szpiku, surowicę), oraz mysi model in vivo. Realizowane będą 3 zadania badawcze:
Zadanie 1. Walidacja PRDX1 oraz innych enzymów antyoksydacyjnych z rodziny TXN jako celów terapeutycznych w B-ALL w modelach linii komórkowych.
1A. Zbadanie efektów zahamowania ekspresji PRDX1 na przeżycie i proliferację komórek B-ALL.
1B. Zbadanie czy zahamowanie proliferacji komórek białaczkowych wynikające z zablokowania ekspresji PRDX1 zależy od cystein.
1C. Zbadanie odpowiedzi transkrypcyjnej komórek białaczkowych na zahamowanie ekspresji PRDX1 za pomocą wysokoprzepustowych metod genetycznych.
1D. Badanie skuteczności terapii łączących inhibitory enzymów antyoksydacyjnych z rodziny TXN z chemioterapeutykami stosowanymi w leczeniu B-ALL.
Zadanie 2. Zbadanie biomarkerów stresu oksydacyjnego oraz ekspresji enzymów antyoksydacyjnych z rodziny TXN w materiale pobranym od pacjentów z B-ALL.
2 A. Zgromadzenie materiału od pacjentów i bazy klinicznej dorosłych i dzieci z rozpoznanym B-ALL
2 B. Ocena biomarkerów stresu oksydacyjnego w surowicy pobranej od pacjentów B-ALL
2 C. Ocena poziomu ekspresji enzymów z rodziny TXN u pacjentów B-ALL
2 D. Analiza statystyczna parametrów redoks w odniesieniu do danych klinicznych
Zadanie 3. Zbadanie skutków zablokowania enzymów antyoksydacyjnych z rodziny TXN in vivo w mysim modelu ludzkiej białaczki.
Wpływ rezultatów: B-ALL jest najczęstszym nowotworem pediatrycznym. W leczeniu B-ALL stosuje się prawie wyłącznie klasyczną chemioterapię. Większość chorych dobrze odpowiada na leczenie indukujące remisję, jednak u około 20% pacjentów dochodzi do wznowy, często opornej na leczenie. Lepsze poznanie biologii B-ALL oraz mechanizmów molekularnych odpowiedzialnych za proliferację i przeżycie limfoblastów, w szczególności roli enzymów antyoksydacyjnych z rodziny TXN, przyczyni się do poprawy skuteczności istniejących metod leczenia i może wskazać nowe cele w terapii B-ALL.
PRDX1, jako enzym metabolizujący nadtlenki, pełni ważne funkcje sygnalizacyjne. Dodatkowo, w warunkach stresu oksydacyjnego, PRDX1 może pełnić funkcję białka opiekuńczego. Nie wszystkie funkcje PRDX1 zależą od aktywności związanej z usuwaniem nadtlenków. Jak dotąd nie jest jasne, czy anty-apoptotyczna funkcja PRDX1 zależy od cystein i aktywności związanej z metabolizmem nadtlenków. W niniejszym projekcie spróbujemy odpowiedzieć na to pytanie. Lepsze poznanie działania anty-apoptotycznego PRDX1 przyczyni się do powstania nowych, bardziej selektywnych inhibitorów tego enzymu.

W ciągu ostatnich lat zaobserwowano trudny do wytłumaczenia wzrost zachorowań na nowotwory wywodzące się z układu krwiotwórczego. Obecnie najczęściej diagnozowanym rodzajem białaczki jest przewlekła białaczka limfocytowa (PBL) – rozrost nowotworowy wywodzący się z limfocytów B. Przebieg przewlekłej białaczki limfocytowej wykazuje znaczne różnice – u części pacjentów nowotwór rozwija się powoli i nie wymaga leczenia, u innych choroba szybko postępuje, rozwija się lekooporność, a choroba wymaga leczenia wielolekowymi schematami. Z uwagi na zaawansowany wiek chorych (w Polsce mediana wieku w chwili rozpoznania wynosi 72 lata), niezmiernie istotne jest opracowanie bezpiecznych schematów terapeutycznych o jak najmniejszych działaniach niepożądanych. W środowisku hematologów w ciągu ostatnich lat wielokrotnie podejmowany był postulat stworzenia terapii wolnej od chemioterapii. Wielu lekarzy skłania się ku zastosowaniu terapii celowanej w skojarzeniu ze specyficznymi inhibitorami szlaków przekazywania sygnału. Opracowanie takich terapii powinno być poprzedzone wnikliwymi badaniami na poziomie biologii komórki.
Jednym z przykładów terapii celowanej są szeroko stosowane przeciwciała monoklonalne anty-CD20. Przeciwciała te wiążąc się z obecnym na komórkach nowotworowych antygen CD20 uruchamiają szereg mechanizmów angażujących komórki układu odpornościowego i prowadzących do eliminacji nowotworu. Związanie się przeciwciała z cząsteczką CD20 powoduje bezpośrednie uśmiercenie komórki nowotworowej na drodze uruchomienia kaskady białek tzw. układu dopełniacza oraz programowanej śmierci komórek. Terapia przeciwciałami anty-CD20 angażuje również mechanizmy nieswoistej odpowiedzi immunologicznej takie jak cytotoksyczne działanie komórek NK oraz fagocytozę, czyli pochłanianie i trawienie komórek nowotworowych przez makrofagi.
Przeciwciała anty-CD20 charakteryzują się dobrą tolerancją oraz niewielkimi działaniami niepożądanymi i z powodzeniem stosowane są w schematach wielolekowych, jednak stosowane w monoterapii rzadko dają całkowite wyleczenia. Dlatego od lat podejmowane są próby zwiększenia skuteczności przeciwciał anty-CD20 poprzez skojarzenie ich z nowymi lekami stosowanymi w onkologii. Wyniki naszych eksperymentów opublikowanych w międzynarodowych czasopismach naukowych wskazują, że zastosowanie pewnych nowych związków stosowanych lub będących w fazie badań klinicznych w hematoonkologii prowadzi do uwrażliwienia komórek nowotworowych ustalonych linii komórkowych na działanie przeciwciał anty-CD20. Dzięki współpracy z Instytutem Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie nasze obserwacje potwierdziliśmy w próbkach pozyskanych od pacjentów z PBL.
Następnym etapem naszych badań powinno być zatem zweryfikowanie tych obserwacji w modelu zwierzęcym. Taki też jest cel niniejszego projektu. Planujemy w nim stworzyć modele mysie pozwalające nam kompleksowo ocenić potencjał terapeutyczny proponowanych przez nas kombinacji. Modele mysie, choć daleko im do idealnego odwzorowania rzeczywistości pozwolą nam na zidentyfikowanie korzystnych i niekorzystnych interakcji pomiędzy przetestowanymi przez nas w układzie in vitro lekami. Ponadto projekt zakłada stworzenie specjalistycznej platformy pozwalającej na ocenę parametrów istotnych dla terapii przeciwciałami anty-CD20.
Połączenie informacji uzyskanych w badaniach in vitro oraz badań w modelu mysim pozwoli nam uzyskać pełniejszy obraz efektywności proponowanych przez nas kombinacji. Otrzymane przez nas wyniki mogą być zatem przesłanką do podjęcia badań klinicznych najbardziej obiecujących kombinacji.

Wczesne etapy nowotworzenia, jak również progresja nowotworu i przerzutowanie są silnie powiązane z reakcją zapalną. Po utworzeniu guza, komórki nowotworowe przyczyniają się do rozwoju przewlekłego zapalenia, stymulując naciek prozaplanych komórek układu odpornościowego. Naciekające guz komórki immunologiczne stymulują angiogenezę, zwiększają przepuszczalność naczyń krwionośnych, jak również wzmagają proliferację komórek nowotworu i kolonizację odległych organów. Formowanie nowych naczyń krwionośnych ma kluczowe znaczenie dla rozwoju nowotworu, a proces ten jest silnieregulowany przez stan zapalny rozwijający się w mikrośrodowisku nowotworu.
Interakcja pomiędzy ligandem CD200 i jego receptorem CD200R, reguluje odpowiedź immunologiczną i reakcję zapalną w przebiegu infekcji, chorób autoimmunizacyjnych i nowotworowych. Dokładny mechanizm działania ścieżki sygnałowej zależnej od CD200R nie jest w pełni poznany. Niedawno pokazaliśmy, że ścieżka sygnałowa CD200R reguluje arteriogenezę (proces powiększania istniejących tętnic), przywracanie normalnego przepływu krwi oraz zwiększania światła naczyń krwionośnych. Co więcej, w badaniach wstępnych, udało się nam pokazać, że CD200R reguluje proces angiogenezy w mysim modelu nowotworowym. Myszy pozbawione CD200 charakteryzowały się bardziej intensywnym ukrwieniem implantów matrigelowych zawierających komórki czerniaka, jak również zwiększony rozmiar nowoutworzonych naczyń krwionośnych. Co istotne, parametry naczyniowe korelowały ze zwiększoną frakcją prozapalnych, niezróżnicowanych makrofagówi subpopulacji proangiogennych limfocytów T. Stawiamy hipotezę, że ścieżka sygnałowa CD200R hamuje angiogenezę nowotworową.
Zbadamy wpływ modulacji CD200R na rozwój naczyń krwionośnych w implantach matrigelu z komórkami mysiego czerniaka B78. Model ten posiada wiele zalet: pozwala na bardzo powtarzalne badanie angiogenezy w stosunkowo małych guzach. Ponadto, umożliwia modyfikowanie mikrośrodowiska guza (np. użycie: inhibitorów, czynników wzrostu, transferu komórek). Do badań wykorzystamy myszy z wyłączoną ścieżką CD200R (Cd200-/-) i myszy typu dzikiego. Będziemy też badać wpływ zwiększenia stymulacji CD200R (przeciwciałem agonistycznym) i blokady CD200R (rozpuszczalnym receptorem CD200R-Fc). Zastosowanie cytometrii przepływowej, analizy histologicznej, a także deplecji i transferu adoptywnego wybranych komórek immunologicznych iv vivo, umożliwi nam zidentyfikowanie populacji odpowiedzialnych za regulację angiogenezy nowotworowej, zależnej od CD200R. Ponadto, zbadamy profil wydzielanych czynników zapalnych, regulowanych przez CD200R. Komórki immunologiczne
eksprymujące CD200R i posiadające proangiogenne właściwości zostaną wyizolowane i zbadane pod kątem wydzielania czynników prozapalnych. Zostanie również przeprowadzona analiza ekspresji genów regulowanych przez CD200R. Wyniki tych badań będziemy weryfikować w modelu tworzenia kapilar przez zarodkowe komórki śródbłonka (in vitro), jak i w implantach matrigelowych z komórkami nowotworowymi (in vivo).
Obecnie, wiedza o oddziaływaniu komórek immunologicznych na rozwijający się nowotwór wykorzystywana jest w immunoterapii chorób nowotworowych. Modulacja aktywności poszczególnych populacji komórek immunologicznych prowadzi do wyraźnej poprawy wyleczalności. Jednak wciąż duża część tych skomplikowanych interakcji pozostaje niewyjaśniona. Poznanie mechanizmów, za pomocą których CD200R reguluje stan zapalny i angiogenezę w mikrośrodowisku guza, może mieć duże znaczenie dla zrozumienia przebiegu powstawania i progresji nowotworów. Może również przyczynić się do zwiększenia efektywności immunoterapii w chorobach nowotworowych.

Przewlekła białaczka szpikowa (PBSz) jest modelowym nowotworem badanym od wielu lat, jednak zmiany genetyczne odpowiedzialne za progresję choroby są słabo poznane. Podstawowym celem projektu jest wykrycie aberracji w genomie i epigenomie PBSz odpowiedzialnych za niekorzystny przebieg choroby, czyli oporność na terapię celowaną i/lub progresję do fazy ostrej, przy zastosowaniu technik wysokoprzepustowych. Następnym celem jest zbadanie potencjalnej roli biologicznej odkrytych aberracji i próba eksperymentalnego blokowania w modelach in vitro.
W proponowanym projekcie poszukiwanie nowych aberracji genetycznych i epigenetycznych w PBSz zostanie wykonane z użyciem technologii wzbogacania bibliotek DNA w określone sekwencje (eksomowe oraz wyspy CpG) a następnie sekwencjonowania wysokoprzepustowego. W następnym etapie na modelach PBSz in vitro zostanie zbadana rola biologiczna wybranych aberracji w progresji choroby i lekooporności (m.in. poprzez wyciszanie genów, kierunkową mutagenezę) oraz próba eksperymentalnego zablokowania wykrytych celów przy zastosowaniu modelowania komputerowego i syntezy aptamerów.

Pomimo coraz częstszego stosowania sekwencjonowania wysokoprzepustowego, wiele nowotworów pozostało wciąż słabo scharakteryzowanych, czego przykładem jest przewlekła białaczka szpikowa, zwłaszcza pod kątem zmian odpowiedzialnych za progresję choroby. Poznanie nowych zmian genetycznych i epigenetycznych w PBSz oraz zbadanie ich znaczenia biologicznego na modelach komórkowych może przyczynić się do lepszego zrozumienia patogenezy PBSz. i do opracowania nowych, lepszych terapii dla pacjentów, u których choroba ma niekorzystny przebieg, jak również takich terapii, które uderzając w nowotworowe komórki macierzyste dadzą szansę na całkowite wyleczenie.
Realizacja grantu HARMONIA umożliwiłaby nie tylko kontynuację ale znaczące rozszerzenie wieloletniej współpracy pomiędzy kierownikiem projektu (dr T. Stokłosa) a partnerem zagranicznym (dr hab. T. Skórski). Zespół wykonawców obejmujący naukowców (genetyków, biotechnologów i bioinformatyków) oraz klinicystów i nowoczesny warsztat do badań genetycznych (platforma NGS) dostępny od niedawna na WUM z jednej strony, a z drugiej strony możliwości badań translacyjnych na modelach in vitro włącznie z modelowanie komputerowym i syntezą nowych cząsteczek u partnera zagranicznego oraz jego ogromne doświadczenie i ekspertyza w badaniach nad molekularną patogenezą białaczek dają realną szansę na dokonanie ważnych odkryć. Grant HARMONIA dałby niepowtarzalną szansę na uzyskanie synergii pomiędzy badaniami prowadzonymi pi zez obu partnerów. Mogłoby to przyczynić się do lepszego zrozumienia patogenezy PBSz. i w przyszłości nadziei na lepszą terapię dla chorych. W długim terminie wyniki uzyskane w realizacji grantu mogłyby stanowić wstęp do dalszych badan translacyjnym. na modelach in vivo. Dodatkową korzyść stanowiły by krótkie staże naukowe w celu realizacji zadań badawczych przez młodych członków zespołu u partnera zagranicznego, które przyczyniłyby się do wymiany doświadczeń i metod badawczych.

Bliźnięta jednojajowe powstają na skutek podziałów jednej komórki jajowej zapłodnionej przez jeden plemnik. Stąd też, MZTs zwykło się traktować jako identyczne zarówno pod względem fizycznym, jak i genetycznym. Niemniej jednak, coraz większa liczba doniesień wyraźnie wskazuje na występowanie fenotypowych różnic pomiędzy MZTs, w tym różnic w statusie chory-zdrowy. Przy założeniu, że genomy i epigenomy bliźniąt jednojajowych są niemal identyczne, wskazanie różnic i powiązanie ich z cechą, która pojawiła się tylko u jednego z bliźniąt jest dużo łatwiejsze niż w przypadku innego rodzaju pokrewieństwa lub jego braku. Celem prezentowanego projektu jest identyfikacje genetycznych i/lub epigenetycznych zmian leżących u podłoża fenotypowych różnic obserwowanych pomiędzy bliźniętami jednojajowymi, w układzie gdzie jedno z bliźniąt w obrębie tej samej pary jest przewlekle chore, natomiast drugie jest zdrowe.

Endometrioza jest częstym, przewlekłym schorzeniem ginekologicznym przejawiającym się obecnością tkanki endomerialnej poza macicą, najczęściej w obrębie miednicy mniejszej. Chorobie towarzyszą przewlekłe dolegliwości bólowe i jest ona jedną z głównych przyczyn niepłodności, co sprawia, że stanowi ona istotny problem kliniczny i społeczny. Etiologia endometriozy jest niejasna, a mechanizmy zjawisk patologicznych z nią związanych są ciągle słabo poznane. Obecność ognisk endometriozy jest najprawdopodobniej przyczyną indukcji przewlekłych reakcji zapalnych manifestujących się gromadzeniem aktywowanych makrofagów i limfocytów oraz wydzielaniem dużych ilości rozmaitych prozapalnych cytokin. Endometriozie towarzyszą również zaburzenia o charakterze autoimmunologicznym i dlatego niektórzy uważają ją za chorobę autoimmunizacyjną. Sugeruje się, że endometrioza i związane z nią zjawiska immunopatogenetyczne mogą być spowodowane zaburzeniem dystrybucji i aktywacji układu limfocytów Treg i Th17. Komórki Treg pełnią funkcje supresorowe, odpowiadają za zjawisko auto-tolerancji i hamują reakcje zapalne i autoimmunizacyjne, natomiast komórki Th17 odpowiadają za pobudzanie reakcji odpornościowych, szczególnie reakcji zapalnych i reakcji o charakterze autoimmunizacyjnym. Z naszych wcześniejszych obserwacji wynika, że endometrioza związana jest ze wzrostem liczby komórek Treg w płynie otrzewnowym, co może mieć istotne znaczenie dla przebiegu zjawisk immunologicznych leżących u podłoża tej choroby. Mechanizm odpowiedzialny za to zjawisko pozostaje jednak nieznany. Nieznana jest również rola jaką w przebiegu endometriozy mogą pełnić komórki Th17. Stawiamy hipotezę, że zaburzenie dystrybucji komórek Treg i, prawdopodobnie Th17 jest związane z chemotaksją i różnicowaniem tych komórek pod wpływem bogatego w cytokiny środowiska płynu otrzewnowego. W związku z tym, celem naszego projektu jest zbadanie wpływu środowiska płynu otrzewnowego pacjentek z endometriozą na chemotaksję i różnicowanie komórek Treg i Th17 oraz ustalenie, czy istnieje korelacja między poziomem swoistych cytokin/chemokin w płynie otrzewnowym, a występowaniem, migracją i różnicowaniem tych komórek.
Badania będą prowadzone w ścisłej współpracy z I Kliniką Położnictwa i Ginekologii Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego. Materiałem użytym do badań będzie płyn otrzewnowy uzyskany w trakcie zabiegu laparoskopowego oraz krew obwodowa od około 30 pacjentek z endometriozą i zbliżonej liczby pacjentek zakwalifikowanych do grupy kontrolnej. W płynie otrzewnowym stężenie wybranych cytokin/chemokin zostanie oznaczone za pomocą testów ELISA. Subpopulacje komórek Treg i Th17 we krwi i w płynie otrzewnowym zostaną natomiast oznaczone metodą cytometrii przepływowej. Chemotaktyczna i stymulacyjna aktywność płynu otrzewnowego będzie oznaczana w testach in vitro z zastosowaniem izolowanych komórek Treg oraz populacji komórek CD4+ zawierającej komórki prekursorowe dla komórek Treg i Th17. Komórki te będą izolowane z kożuszków leukocytarnych przez sortowanie metodą immunomagnetyczną lub na cytometrze przepływowym (FACS Aria). Wyniki poszczególnych badań uzyskanych od pacjentek będą analizowane za pomocą modeli wielokrotnej regresji liniowej i regresji logistycznej.
Uważamy, że zaproponowane przez nas badania przyczynią się do pogłębienia wiedzy dotyczącej przyczyn i mechanizmów zaburzeń układu komórek Treg i Th17 w endometriozie. Wiedza o ta może być przydatna przy tworzeniu koncepcji nowych metod terapii tej częstej aczkolwiek ciągle zagadkowej choroby