Narodowe Centrum Nauki

Nieswoiste choroby zapalne jelit i rak jelita grubego stanowią niezwykle poważny problem zdrowotny w populacji ludzkiej. Celem badań jest zaprojektowanie i /walidowanie nowej formy terapii nieswoistych chorób zapalnych i raka jelita grubego z udziałem innowacyjnych kompleksów złota. Badania wpisują się w aktualny trend w projektowaniu związków o działaniu przeciwzapalnym i przeciwnowotworowym w oparciu o cząstki metali, wzbogacając tę grupę o pochodne lipidowe.
Projekt zakłada scharakteryzowanie właściwości przeciwzapalnych i przeciwnowotworowych związku wyjściowego - TGS, będącego kompleksem złota (III), w modelach zwierzęcych. Kolejny etap badań polegać będzie na zaprojektowaniu pochodnych związku wyjściowego, w których kompleks złota (III) zostanie połączony z fragmentami lipidowymi. Spośród nowo zsyntetyzowanych związków, w oparciu o test ex vivo zaprojektowany specjalnie na potrzeby tego projektu, do dalszych badań zostaną wybrane 1-2 pochodne o potencjalnej aktywności przeciwzapalnej, a ich skuteczność przeciwzapalna i przeciwnowotworowa zostanie potwierdzona również w modelach zwierzęcych. Ostatni etap badań zakłada badania in vitro i in silico, których celem będzie próba ustalenia mechanizmu działania nowych kompleksów.
Wyniki przeprowadzonych badań pozwolą na stworzenie podstaw dla nowej formy terapii chorób zapalnych i nowotworowych jelita grubego w oparciu o innowacyjne kompleksy złota (III), W dalszej perspektywie pozwoli to wytyczyć nowe kierunku badań w onkologii i gastroenterologii w oparciu o nowe narzędzia farmakologiczne i nowe rozwiązania przedstawione przez nasze Konsorcjum. Wartością dodaną będzie opracowanie nowego testu diagnostycznego prowadzonego w warunkach ex vivo, który pozwoli na szybką i rzetelną ocenę potencjalnych właściwości przeciwzapalnych różnorodnych związków. Wyniki posłużą również dla rozwoju kariery naukowej jednego z badaczy uczestniczących w projekcie, stanowiąc podstawę dla jego rozprawy doktorskiej.

Celem pracy będzie pogłębienie wiedzy na temat oleaceiny, związku, który charakteryzuje się unikalnymi właściwościami i może znaleźć zastosowanie w prewencji zarówno wczesnych, jak i późnych zmian miażdżycowych. Planowane działania mają charakter badań podstawowych. Ocena usuwania cholesterolu z komórek piankowatych przez receptor SRB1 i transporter ABC Al oraz transporter ABCG1, przynajmniej częściowo wyjaśni mechanizm działania oleaceiny w tym zakresie, który wciąż pozostaje nierozwiązany.
Oleaceina obecna w oliwie, oliwkach i liściach oliwki europejskiej oraz liściach rodzimego gatunku - ligustra pospolitego wykazuje silne właściwości przeciwutleniajqce i przeciwzapalne. Spektakularne badania (patent US 9,682,056 B2) wykazały, że oleaceina poprzez wzrost ekspresji makrofagowych receptorów zmiatających CD 163 i IL-10 oraz wzrost sekrecji OH-1 może zmniejszać mikrokrwawienia wewnątrzkomórkowe, a przez to zapobiegać pękaniu blaszki miażdżycowej [1]. Stabilizację blaszki miażdżycowej przez oleaceinę potwierdzono w badaniach ex vivo, które przeprowadzono na blaszkach miażdżycowych pobranych z tętnic szyjnych od pacjentów w wyniku endarterektomii [2].
Aktualnie trwające badania potwierdzają, że oleaceina reguluje pracę receptorów zmiatających (SRA, CD36, CD68 oraz LOX-1) odpowiedzialnych za wychwyt cholesterolu przez komórki makrofagów. Obniżenie ekspresji w. w receptorów może prowadzić do hamowania powstawania komórek piankowatych, które są wynikiem akumulacji utlenionej frakcji LDL (oxLDL) przez makrofagi. Komórki piankowate są podstawowym składnikiem budulcowym blaszki miażdżycowej odpowiedzialnej za rozwój miażdżycy tętnic prowadzącej w konsekwencji do udaru mózgu i/lub zawału serca i śmierci organizmu.

Głównym celem tego projektu jest otrzymanie na drodze syntezy chemicznej serii nowych związków z grupy bis-amidyn oraz wstępna analiza ich aktywności biologicznej. Badanie te przyczynią się do poszerzenia wiedzy w przedmiocie syntezy organicznej (klasycznej oraz wykorzystującej promieniowanie mikrofalowe) służącej do otrzymania nowych związków chemicznych. Badania te pozwolą również na poszerzenie biblioteki związków chemicznych, która będzie mogła znaleźć w przyszłości zastosowanie w różnych badaniach naukowych dotyczących również innej tematyki ale związanych z pochodnymi pentamidyny.
W swojej pracy naukowej zajmuję się poszukiwaniem nowych chemoterapetyków w grupie związków posiadających dwie grupy amidynowe, tzw. bis amidyn. Najbardziej znanym lekiem z tej grupy jest pentamidyna, stosowana w terapii pneumocystozowego zapalenia płuc (zakażeń Pnemocystis carinii) oraz w leczeniu chorób tropikalnych wywoływanych przez pierwotniaki (np. leiszmanioza). Związki z grupy bis-amidyn cechują się szeroką aktywnością biologiczną. Działają m.in. przeciwpierwotniakowo, przewgrzybiczo, przeciwbaktetyjnie, przeciwnowotworowo, przeciwzapalnie, wykazują działanie na receptory NMDA. Opracowałem stosunkowo wydajne metody syntezy nowych bis-amidyn. Otrzymuje je głównie poprzez przekształcenia grupy cyjanowej otrzymanych wcześniej bis-nitryli, które syntetyzuję różnymi metodami, głownie w reakcjach O-alkilowania 4- hydroksybenzonitryli lub aromatycznej substytucji nukleofilowej parapodstawionych halogenobenzonitryli. Przekształceń grupy cyjanowej dokonuję głównie w oparciu o sprawdzone metody: Pinera lub otrzymanie oksymu, a następnie jego redukcję. Otrzymałem do tej pory kilka serii nowych bis-amidyn o potwierdzonej aktywności przeciw Pneumocystis carinii oraz przeciwbakteryjnej. Związki po otrzymaniu, odpowiednim oczyszczeniu oraz potwierdzeniu ich struktury poddaję wstępnym badaniom aktywności biologicznej. Na podstawie tych badań przeprowadzam analizę SAR (Structure Activity Relationship) i wybieram struktury do dalszych badań in vitro oraz selekcjonuję wiodące struktury do dalszych syntez.

Projekt przewiduje otrzymanie serii nowych związków z grupy bis-amidyn o spodziewanej wysokiej aktywności biologicznej. Związki zaprojektowałem w oparciu o przegląd literaturowy oraz przy wsparciu metod modelowania molekularnego. Struktury nowych związków zaplanowałem również w oparciu o moje dotychczasowe badania, w których otrzymałem serie związków posiadających szereg różnych podstawników przy pierścieniach aromatycznych połączonych ze sobą łącznikami alifatycznymi lub alifatyczno-aromatycznymi. Dla otrzymanych dotychczas związków określono profil działania (w tym ich aktywność przeciw P. carinii oraz przeciwbakteryjną). Otrzymane wyniki są optymistyczne i zachęcają do prowadzenia dalszych badań. Ustaliłem m.in. że wprowadzenie do pierścieni grup nitrowych oraz aminowych znacząco zwiększa aktywność związków. Związki te działają na P. carinii już w stężeniach nanomolowych. Planuję otrzymać serie nowych bis-amidyn o budowie niesymetrycznej (różniącymi się podstawieniem w pierścieniach aromatycznych) oraz serie nowych symetrycznych związków z różnymi kombinacjami podstawników, których obecność według przeprowadzonej analizy SAR zwiększa aktywność nowych pochodnych. Związki, których syntezę zaplanowałem w ramach tego projektu będą otrzymane w wyniku kilkuetapowych syntez organicznych, w wybranych przypadkach wspomaganych promieniowaniem mikrofalowym. Synteza organiczna bazuje na pewnych i sprawdzonych reakcjach chemicznych. Wszystkie pochodne będą oczyszczane za pomocą krystalizacji i chromatografii kolumnowej (grawitacyjnej lub typu flash). Budowa nowych związków będzie potwierdzona widmami 1H NMR, 13C NMR, HSQC, HMBC, 13C CP/MAS, MS, analizą elementarną oraz metodami krystalograficznymi dla wybranych związków.

Pneumocystoza, czyli ciężkie oportunistyczne pneumocystozowe zapalenie płuc (PCP - pneumocystis carinii pnemonia) dotyka osoby z upośledzonym układem odpornościowym. Dotyczy to przede wszystkim chorych na AIDS. Pomimo, że ilość przypadków PCP w grupie HIV-pozytywnych pacjentów zmalała wraz z wprowadzeniem HAART (High-Active Antiretroviral Therapy), PCP nadal pozostaje główną przyczyną śmiertelności w tej grupie. Ponad to, w ostatnich latach pojawiło się wiele doniesień o występowaniu PCP u osób po przeszczepach, chemioterapii w leczeniu nowotworów, leczonych przewlekle kortykosteroidami czy pacjentów z chorobami autoimmunologicznymi (np. chorobą Crohna). PCP jest chorobą bardzo trudną w leczeniu ze względu nietypowy charakter patogenu (brak wrażliwości na leki p-grzybicze oraz większość antybiotyków) oraz stosunkowo wysoką toksyczność stosowanych leków (np. pentamidyny). Istnieje zatem duża potrzeba poszukiwania nowych związków o dużej aktywności biologicznej, które mogłyby potencjalnie w przyszłości znaleźć zastosowanie w terapii PCP. 4.Spodziewany efekt. Podstawowym efektem przedstawionego projektu będzie otrzymanie, oczyszczenie i potwierdzenie struktury serii zaplanowanych związków o spodziewanej aktywności biologicznej. Wyniki prac zostaną opublikowane w międzynarodowych czasopismach. Planuję otrzymać serię nowych bis-amidyn o budowie niesymetrycznej oraz symetrycznej z różnymi podstawnikami w pierścieniach. Tego typu pochodne nie są dotychczas opisane w literaturze, ani badane pod kątem ich aktywności przeciwbakteryjnej oraz przeciw Pneumocystis carinii. Projekt wzbogaci bibliotekę pochodnych pentamidyny o nowe związki. Uzyskane wyniki będą częścią materiału do rozprawy habilitacyjnej kierownika projektu. W związku z tym, że projekt ten wpisuje się w ramy chemii medycznej, konieczne będzie przeprowadzenie badań aktywności biologicznej (poza przedstawionym wnioskiem). Aktywność związków zostanie określona w oparciu o badanie aktywności in vitro wobec Pneumocystis carinii (w ramach współpracy naukowej z Department of Internal Medicine, University of Cincinnati) oraz przeciwbakteryjnej (w ramach współpracy naukowej z Narodowym Instytutem Leków).

Przemysł farmaceutyczny to jedna z najszybciej rozwijających się jak i najbardziej dochodowych gałęzi globalnej gospodarki. Jego istnieniu zawdzięczamy możliwość leczenia coraz większej liczby chorób. Fakt ten wiąże się jednocześnie z potrzebą rozwoju współczesnej nauki na świecie, szczególnie tej związanej z poszukiwaniami nowych chemioterapeutyków. Nowotwory są drugą po chorobach układu krążenia przyczyną zgonów nie tylko w Polsce ale także w Europie i USA. W leczeniu chorób nowotworowych niezmiernie ważną rolę odgrywa chemioterapia. Cechą charakterystyczną wielu leków antynowotworowych jest ich ograniczona skuteczność oraz rozległe działania niepożądane bardzo często uniemożliwiające kontynuację terapii. Dlatego też poszukiwanie nowych leków przeciwnowotworowych to jeden z kluczowych kierunków badań naukowych. Dostępność nowoczesnych technologii i związany z tym rozwój badań nad patogenezą nowotworów stały się podstawą powstania różnych strategii poszukiwań nowych leków. Jedną z nich jest poszukiwanie naturalnych substancji, które w formie niezmienionej lub zmodyfikowanej wykazują wysoką aktywność antyproliferacyjną w stosunku do komórek nowotworowych i mogą samodzielnie lub w połączeniu z innymi lekami (terapia złożona) być stosowane w leczeniu chorób nowotworowych. W literaturze pojawia się coraz więcej doniesień na temat nowych substancji aktywnych, które wykazują silny wpływ antybakteryjny, antygrzybiczny czy antynowotworowy, lecz pomimo to nadal trwają poszukiwania związków, które wykazywałyby wysoką skuteczność w hamowaniu namnażania komórek nowotworowych, a jednocześnie nie wpływały negatywnie na funkcjonowanie zdrowych komórek. Warto zauważyć, iż trudności jest więcej niż można by się spodziewać. Sama skomplikowana synteza chemiczna nastręcza wielu problemów, czy to z wytworzeniem substancji, jej modyfikacją czy też z jej oczyszczeniem w celu otrzymania produktu o wysokiej czystości. Kolejnym problemem jest rozpuszczalność tej substancji. Związki chemiczne mają różne struktury chemiczne i przestrzenne, co rzutuje na ich zachowanie w rozpuszczalnikach, a w tym w płynach ustrojowych. Trzeba pamiętać, że związek nierozpuszczony nie będzie w stanie przeniknąć do komórek oraz wywołać pożądanego efektu. Wyzwaniem jest zatem nie tylko wynalezienie odpowiedniego związku, jego synteza chemiczna (bądź modyfikacja istniejącej substancji pochodzenia naturalnego) ale także umożliwienie produktowi dobrej rozpuszczalności. Wiele substancji organicznych z łatwością roztwarza się w rozpuszczalnikach organicznych, natomiast płyny ustrojowe, w których przyjdzie działać substancji, zawierają wodę, która niestety słabo rozpuszcza molekuły organiczne. Celem niniejszego projektu jest poszukiwanie nowych pochodnych substancji pochodzenia roślinnego (alloksantoksyletyn), które będą wykazywać aktywność antyproliferacyjną wobec komórek nowotworowych porównywalną do wiodących cytostatyków, a obniżoną cytotoksyczność wobec komórek prawidłowych. Powszechnie znanymi substancjami charakteryzującymi się wysoką lipofilowością są kwasy tłuszczowe, które mają duże powinowactwo do błon biologicznych i mogą wpływać na ich strukturę, a w efekcie na właściwości błony, na jej przepuszczalność jak i selektywność. Zaplanowane modyfikacje poprzez łączenie alloksantoksyletyny z wybranymi kwasami tłuszczowymi spowodują zmianę właściwości lipofilnych, co będzie skutkować wzrostem aktywności cytostatycznej tych substancji.

Przewlekłe zapalenie ucha środkowego z perlakiem jest stale dużym problemem terapeutycznym. W trakcie rozwoju perlaka dochodzi do „napełzania” i proliferacji komórek nabłonka rogowaciejącego z przewodu słuchowego zewnętrznego do jamy ucha środkowego, powstania przewlekłego stanu zapalnego w wyniku aktywacji układu immunologicznego. W efekcie dochodzi do zniszczenia struktur ucha środkowego i wewnętrznego prowadząc do utraty słuchu, porażenia nerwu twarzowego, zaburzeń równowagi (dysfunkcja przedsionka), jak również stanowi zagrożenie powikłaniami wewnątrzskroniowymi i wewnątrzczaszkowymi. Przyczyny powstawania i rozwoju perlaka nie są do końca wyjaśnione. Leczeniem z wyboru jest leczenie chirurgiczne. W naszych poprzednich badaniach wykazaliśmy istotną rolę odporności wrodzonej w rozwoju perlaka nabytego ucha środkowego. Nasze badania wstępne wykazały obecnośc białka HMGB1 i jego receptora RAGE, a także obecność receptorów Toll-podobnych w mikrośrodowisku perlaka. Obecnie coraz więcej danych wskazuje na kluczową rolę mikropęcherzyków błonowych (ang. extracellular vesicles; EV) w patogenezie przewlekłych stanów zapalnych, ponieważ EV pełnią rolę nośników różnych białek m.in.prozapalnych modulując czynności innych komórek. Biorąc pod uwagę wyniki naszych badań wstępnych wysuwamy hipotezę, że poprzez uwolnienie zawierających HMGB1 mikropęcherzyków z mikrośrodowiska perlaka, rozprzestrzeniających się również systemowo poprzez układ krążenia, dochodzi do rozwoju miejscowego i ogólnego stanu zapalnego. W związku z tym, iż mikropęcherzyki mogą być pobierane na drodze endocytozy przez komórki układu odpornościowego, takie jak makrofagi, ale również przez inne komórki (fibroblasty, śródbłonki naczyń), chcemy ocenić bezpośredni wpływ mikropęcherzykowego HMGB1 (EV-HMGB1) na te komórki w badaniach in vitro jak i ex vivo. Zakładamy również, że ocena ilości mikropęcherzyków oraz poziomu HMGB1 w surowicy może być markerem stanu zapalnego i korelować z klinicznym zaawansowaniem perlaka lub jego nawrotami.

Cel projektu: Celem projektu jest ocena wpływu żelaza i cynku na wyrzut NETs. Poza tym, poprzez zbadanie wyrzutu sieci u pacjentów z niedokrwistością z niedoboru żelaza oraz z hemochromatozą (choroba charakteryzująca się akumulacją żelaza w organizmie) ocenię czy niedobór i nadmiar badanego metalu rzutuje na zdolność neutrofilów do uwalniania sieci i na wydajność zabijania patogenów w obrębie NETs. Do ostatniego etapu badań włączę myszy z hemochromatozą oraz myszy karmione paszą ubogą oraz przesyconą w cynk i żelazo. Na podstawie wyników badań w modelu mysim postaram się wyjaśnić, czy dieta uboga w mikroelementy lub nadmierna suplementacja tych pierwiastków może działać niekorzystnie na mechanizmy odporności wrodzonej.
Oczekiwane rezultaty: Wyniki naszych badań przyczynią się do lepszego zrozumienia jak homeostaza wybranych metali wpływa na funkcje granulocytów, w tym wyrzut NETs. Co ważniejsze, oszacujemy wpływ nadmiernej suplementacji mikroelementami na odporność nieswoistą.