Narodowe Centrum Nauki

BACKGROUND. Nosocomial diarrhea is a common complication of hospitalization in children. Most commonly, it is
caused by in-hospital infections or antibiotic treatment. One of the possible risk factors for nosocomial diarrhea is gut
dysbiosis. Even though associations between microbiota and diarrhea in children were previously described, to date no
studies have assessed microbiota composition in children before the occurrence of diarrhea symptoms. Because of that,
it is not known which alterations of the intestinal microbial ecosystem were caused by the disease, and which were
present before.
AIM. To test the hypothesis that the baseline gut microbiota diversity, composition and function of pediatric inpatients
on admission to the hospital is associated with the risk of developing nosocomial diarrhea.
METHODS. In this nested case-control study, the baseline cohort will be recruited from among the inpatients of the
Department of Paediatrics of the Medical University of Warsaw. The eligible children will be aged between 15 and 36
months. Children with preexisting diarrhea, vomiting or children transferred from other wards will be excluded. After
entering the cohort, a ‘baseline’ stool sample will be taken from all of the participants within 24 hours of admission to
the hospital and stored for future testing. Additionally, in patients, who will receive antibiotics as a part of hospital
treatment, this first sample will have to be obtained before the first dose. After obtaining the first stool sample, all of
the included patients will be prospectively monitored throughout the hospital stay for the occurrence of nosocomial
diarrhea, defined as 3 or more loose stools per day for a minimum of a 24 hour period, arising after ≥72 hours of
hospitalization. In case of a nosocomial diarrhea occurrence, another stool sample will be taken and stored, and the
patient will join the ‘case group’. From this moment, the subsequently recruited patients will be screened for matching
by age, date of admission and antibiotic class with the patients from the case group (case:control ratio 1:2). After
successful matching, the second stool sample will be taken from the control patient on the same consecutive day of
hospital stay as when the corresponding patient from the case group developed diarrhea. As a result of this procedure,
we will acquire two groups: a case group counting 34 participants, and a control group counting 68 participants. From
each of the patients in these groups, two stool samples will be available for microbiota analysis. Finally, we will analyze
gut microbiota in the samples using shallow shotgun sequencing NGS method, which is a specific type of Whole Genome
Sequencing, allowing high quality observation of microbiota changes at the level of species. We will also test the stool
samples of patients with diarrhea for the presence of common diarrheal pathogens. Finally, by comparing the acquired
data between the case group and the control group, we will analyze the associations between microbiota characteristics
and the risk of nosocomial diarrhea. Before the start of the study, its protocol will be reviewed by the Bioethics
Committee of the Medical University of Warsaw.
EXPECTED RESULTS. The results of this project will significantly expand the knowledge about microbiota-host interaction
in the pathogenesis of diarrhea in children. Most importantly, we will establish if initial microbiota status at admission is
associated with the risk of nosocomial diarrhea. Since we will examine the etiology of diarrheal episodes, this study may
also contribute to the understanding of pathogenesis of other types of diarrhea. In the future, when the techniques of
microbiota analysis develop, the results of this project may find a significant practical application. It might become
possible to use microbiota characterization to identify patients at a higher risk of certain diseases or complications,
which in turn may open up an opportunity for targeted, preventive interventions tailored for individual microbiota
patterns.

Wiedza na temat roli mikrobioty jelitowej w utrzymaniu homeostazy organizmu
człowieka w ostatnich latach zaczęła się dynamicznie rozwijać. Uważa się, że jej aktywność
ma kluczowe znaczenie dla zdrowia szczególnie poprzez wpływ na układ immunologiczny,
układ nerwowy oraz metabolizm substancji odżywczych i ksenobiotyków. Wyniki badań
dotyczących zmian w strukturze przyjmowanych doustnie związków pod wpływem mikrobioty
jelitowej spowodowały, że przy ocenie wpływu na organizm człowieka substancji
występujących w żywności oraz lekach obecnie niezbędne jest uwzględnianie aktywności
biologicznej metabolitów powstających w jelicie.
Jedną z grup związków podlegających istotnym zmianom strukturalnym pod wpływem
mikrobioty jelitowej są elagotanoidy, będące wielkocząsteczkowymi polifenolami, które
występują w wielu roślinnych surowcach leczniczych oraz są składnikami produktów
spożywczych tj. orzechów włoskich, migdałów, soku z granatu, malin, truskawek, czy
dojrzewającego w beczkach dębowych wina. Wiadomo jednak, że elagotanoidy ulegają
metabolizmowi pod wpływem mikrobioty jelitowej do urolityn, które w przeciwieństwie do
elagotanoidów są małocząsteczkowymi związkami o dobrze udokumentowanej
biodostępności, mogącymi osiągać wysokie stężenia we krwi, tkankach, kale oraz moczu.
Badania aktywności biologicznej in vitro przeprowadzone dla urolityn wykazały, że
szczególnie jeden metabolit, mianowicie urolityna A wykazuje silne właściwości
przeciwzapalne. Pomimo bardzo obiecujących wyników badań okazało się, że urolityna A
natychmiast po wchłonięciu w jelicie jest dezaktywowana pod wpływem metabolizmu
człowieka, przez co może wykazywać działanie przeciwzapalne jedynie miejscowo w jelicie,
ale nie na poziomie całego organizmu.
Celem projektu jest przeprowadzenie chemicznych modyfikacji urolityny A
prowadzących do powstania cząsteczki o zbliżonej aktywności hamującej stan zapalny, jednak
nie ulegającej szybkiemu metabolizmowi w organizmie. Pomyślna realizacja złożonego
projektu umożliwi bliższe spojrzenie na molekularne mechanizmy aktywności przeciwzapalnej
urolityny A i pozwoli wskazać elementy budowy cząsteczki warunkujące wpływ na konkretne
szlaki biochemiczne. Realizacja projektu doprowadzi do wyselekcjonowania takich modyfikacji
strukturalnych, które są stabilne, nietoksyczne, nie wpływają na aktywność, ale jednocześnie
zapobiegają szybkiej dezaktywacji. W dalszej perspektywie otrzymane wyniki mogą stanowić
podstawę do opracowania nowego leku wywodzącego się z obszaru leku pochodzenia
naturalnego; pierwszego leku bazującego na postbiotycznych metabolitach produkowanych
przez mikrobiotę jelitową człowieka.
 

Według Europejskiej Agencji Chemikaliów mikroplastiki są bardzo małymi cząstkami złożonymi z
mieszanin polimerów, dodatków funkcjonalnych i pozostałości poprocesowych. Zanieczyszczenia wód
powerzchniowych mikroplastikami obejmują: mikroplastiki pierwotne z żywic stosowanych w
przemyśle oraz mikroplastiki wtórne wytwarzane podczas fragmentacji większych kawałków
polimerów. Pomimo coraz większej liczby prac naukowych na temat tworzyw sztucznych w
środowisku, badania dotyczące starzenia mikroplastików pozostają ograniczone. Spożycie mikro- i
nanoplastików zaobserwowano u wielu gatunków bezkręgowców, szczególnie u organizmów
filtrujących m.in. skorupiaków i małży. Zmiany spowodowane procesem starzenia mikroplastików
mogą wpływać na ich aktywność biologiczną i procesy sorpcyjne. Istnieją doniesienia naukowe
wskazujące na możliwość przenoszenia do wnętrza organizmów żywych, hydrofobowych, toksycznych
związków organicznych zaadsorbowanych na powierzchni mikrocząstek plastików. Możliwe jest także
uwalnianie szkodliwych dodatków funkcjonalnych. Opublikowano wiele artykułów na temat sorpcji na
plastikach: wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych, wybranych farmaceutyków i
produktów higieny osobistej. Jednak nie prowadzono dotychczas badań dotyczących interakcji
mikroplastików z lekami przeciwdepresyjnymi. Leki przeciwdepresyjne są jedną z najważniejszych grup
leków uwalnianych do wód powierzchniowych. Wpływają na organizmy wodne już w niskich
stężeniach, w zakresie kilku μg/l. Co więcej, spożycie leków przeciwdepresyjnych gwałtownie wzrosło
na całym świecie z powodu globalnej „epidemii depresji”.
Pierwotniaki odgrywają ważną rolę w środowisku wodnym jako konsumenci pierwszego rzędu. Orzęski
- filtratory odżywiają się bakteriami, zawieszoną materią organiczną i fitoplanktonem. Stanowią ważne
ogniwo łańcucha pokarmowego od bakterii do organizmów wyższych. Mogą być więc istotnymi
wektorami przenoszącymi zaodsorbowane i wchłonięte substancje toksyczne, w tym mikroplastiki, w
sieci pokarmowej.
Pierwszym celem projektu jest ocena toksyczności ostrej i chronicznej różnych rodzajów
mikroplastików (polistyrenu, PET i polichlorku winylu; zarówno bezbarwnych, jak i zabarwionych) dla
orzęsków: Spirostomum ambiguum i Tetrahymena thermophila. Ocenione zostaną zarówno surowe,
jak i starzone tworzywa sztuczne. Mikroplastiki zostaną poddane procesowi starzenia w aparacie do
przyspieszonego starzenia SUNTEST CPS + firmy Atlas, a także podczas inkubacji przez 6 i 12 miesięcy
w komorze klimatycznej. Uważamy, że obojętne cząstki będą spożywane przez pierwotniaki i mogą
wpłynąć na ich funkcje życiowe: zachowania żywieniowe i tempo wzrostu. Oczekujemy, że starzenie i
wietrzenie tworzyw sztucznych będzie miało wpływ na toksyczność poprzez zmianę składu, kształtu i
właściwości fizykochemicznych cząstek. W teście pobierania / wydalania pokarmu pierwotniaki
zostaną unieruchomione i będą obserwowane pod mikroskopem KEYENCE VHZ 700.
Drugim celem projektu jest ocena wpływu mikroplastików na toksyczność i bioakumulację leków
przeciwdepresyjnych (fluoksetyny, sertraliny, paroksetyny i duloksetyny) w pierwotniakach. Nasze
wcześniejsze badania wskazują na wysoką wrażliwość S. ambiguum na sertralinę i inne leki
przeciwdepresyjne. Uważamy, że mikroplastiki mogą służyć jako wektory umożliwiające transport
substancji toksycznych do komórek, a proces ten zależy od rodzaju tworzywa sztucznego i warunków
środowiskowych, zwłaszcza pH i zasolenia. Równolegle do oceny bioakumulacji, będzie analizowana
sorpcja i desorpcja antydepresantów na mikroplastikach (przy różnych wartościach pH). Uważamy, że
leki adsorbowane ze środowiska wodnego mogą ulegać desorpcji w kwaśnym środowisku wodniczek
pokarmowych pierwotniaków. Analiza śladowa leków przeciwdepresyjnych w wodzie i komórkach
pierwotniaków zostanie przeprowadzona za pomocą chromatografii z detekcją spektrometrii mas.
Istotną nowością projektu jest zastosowanie dwóch pierwotniaków: bardzo dużego S. ambiguum i
małego T. thermophila różniących się tempem metabolizmu i szybkością wzrostu. Ponadto do badań
zostaną wykorzystane cząstki mikroplastiku o naturalnych, nieregularnych kształtach, uzyskane z
produktów dostępnych na rynku, zarówno surowych, jak i starzonych. Na koniec zostaną ocenione
interakcje między obojętnymi chemicznie cząstkami, a lekami przeciwdepresyjnymi. Badania te
poszerzą naszą wiedzę na temat losów tych klas zanieczyszczeń w środowisku wodnym.