Selenowane polisacharydy- badania nad biosyntezą i zależnością pomiędzy strukturą a aktywnością immunologiczną.

Celem przedstawionego projektu jest otrzymanie na drodze biosyntezy serii nowych, nieopisanych dotąd związków wielkocząsteczkowych - egzopolisacharydów pochodzenia grzybowego (β-glukanów) zawierających w swojej strukturze atomy selenu, a następnie zbadanie wpływu inkorporacji selenu do łańcucha polisacharydowego na ich cechy strukturalne oraz aktywność immunomodulacyjną. Przedstawiony projekt stanowi kontynuację badań prowadzonych w latach 2010-2011, w ramach projektu badawczego własnego MEiN N N405 613238. W wyniku przeprowadzonych w tym okresie badań zoptymalizowano warunki hodowli mycelium L. edodes na podłożach wzbogacanych w związki selenu, przeprowadzono badania specjacyjne organicznych związków selenu biosyntezowanych przez kultury mycelialne, oraz wyizolowano jedną frakcję polisacharydową zawierającą selen. Wstępne badania wpływu wyizolowanej selenowanej frakcji polisacharydowej na proliferację limfocytów krwi ludzkiej wskazały na jej silne i selektywne działanie immunosupresyjne, przy bardzo niskiej toksyczności. Wyniki badań były na tyle obiecujące, że ewentualne zastosowanie otrzymywanych na drodze biosyntezy selenowanych polisacharydów jako immunosupresantów zostało w 2012 roku objęte zgłoszeniem patentowym (P. 402082). Zarówno mechanizm inkorporacji selenu do cząsteczek egzopolisacharydów grzybowych, jak ich budowa i mechanizm wykrytego przez nas we wstępnych badaniach działania immunosupresyjnego są dotąd nieznane. W przedstawionym obecnie projekcie zaplanowano w związku z tym badania mające na celu wyjaśnienie tego interesującego problemu. Dotyczą one równocześnie niezbadanej dotąd problematyki biosyntezy, struktury oraz mechanizmu działania selenopolisacharydów.
Zamierzamy w trzech dziedzinach prowadzonych badań wykorzystać metody:
W części biotechnologicznej badań:
- Biosyntezę wzbogaconych w selen egzoplisacharydów przeprowadzimy na drodze wgłębnej hodowli mycelialnej grzyba leczniczego Lentinula edodes, należącego do klasy Basidiomycetes, wykorzystując podłoża hodowlane wzbogacane w różne związki selenu.
- Zastosujemy (opracujemy) metodę frakcjonowania tych związków umożliwiającą izolację polisacharydów o różnej masie molowej, składzie monosacharydowym i zawartości selenu poprzez użycie do ekstrakcji eluentów o różnej polarności i charakterze chemicznym.
W części analitycznej badań:
- Zastosujemy do badań nieznanego dotąd sposobu w jaki selen jest związany ze strukturą polisacharydów metodę rentgenowskiej spektroskopii absorpcyjnej (XANES, XAFS) oraz magnetycznego rezonansu jądrowego (widma selenowe NMR)
- Przeprowadzimy dokładną analizę budowy selenopolisacharydów, poprzez wykorzystanie metod:
• do oznaczania składu monosacharydowego, po całkowitej hydrolizie, metodę wysokosprawnej chromatografii cieczowej,
• do oznaczania masy molowej izolowanych polisacharydów wykorzystamy technikę chromatografii żelowej (GPLC),
• do oznaczania struktury pierwszorzędowej, wykorzystamy metody degradacyjne, z wykorzystaniem hydrolizy enzymatycznej oraz zmodyfikowanej metody Hakomori - poprzez wstępną metylację, a następnie hydrolizę analizowanych frakcji,
• do oznaczania typu wiązań glikozydowych zastosujemy metody spektralne IR i NMR,
• do oznaczania struktury przestrzennej zastosujemy metody (2D) NMR
W części immunologicznej badań:
- Zbadamy wpływ Se-polisacharydów o zróżnicowanej masie molowej, zawartości selenu i strukturze i na proliferację limfocytów T i B krwi ludzkiej, poprzez przeprowadzenie testów OKT3, PHA i SAC
- Zbadamy czy Se-polisacharydy wykazują zdolność aktywacji makrofagów, komórek NK, oraz czy wpływają na odpowiedź zależną od limfocytów T.
Zakładamy, że wyniki zaplanowanych badań pozwolą wysunąć hipotezę dotyczącą przyczyn nietypowej dla polisacharydów pochodzenia grzybowego, stwierdzonej we wstępnych badaniach aktywności immunosupresyjnej selenowanych frakcji polisacharydowych. Zakładamy również , że uda nam się zbadać, w jakim stopniu inkorporacja selenu do cząsteczki egzopolisacharydów zmienia ich strukturę przestrzenną, co z kolei zapewne wpływa na wiązalność tych związków z receptorami CR-1 i CR-3. Wyniki badań powinny również rozszerzyć zakres wiedzy na temat metabolizmu związków selenu przez grzyby oraz możliwości biosyntezy przez nie selenopolisacharydów. Efektem badań powinny być publikacje w czasopismach z listy JCR oraz doniesienia zjazdowe. Zakładamy, że badania przyczynią się do rozwoju młodej kadry naukowej, stanowiąc przedmiot pracy/prac doktorskich. Jest również prawdopodobne zastosowanie ich wyników do zaprojektowania i otrzymywania innowacyjnego leku o działaniu immunosupresyjnym, należącego do nowej grupy chemicznej.