Udział dwuskładnikowych systemów regulacyjnych w tworzeniu biofilmu S. mutans na powierzchni zębów dzieci oraz osób dorosłych.

Celem planowanych badań jest wykrywanie obecności 13 zidentyfikowanych w genomie S. mutans UA159 (ATCC 700610) dwuskładnikowych systemów regulacyjnych (TCS) oraz zbadanie roli czterech z nich, poprzez konstrukcje delecyjnych mutantów klinicznych izolatów S. mutans, w tworzeniu płytki nazębnej u dzieci oraz dorosłych uwzględniając dwa typy zębów (stałe i mleczne). Otrzymane szczepy ze zinaktywowanymi genami kodującymi domeny sensorowe analizowane będą pod kątem wytwarzanej biomasy oraz struktury tworzonego biofilmu. W ramach niniejszego projektu planowana jest również ocena lekowrażliwości szczepów klinicznych S. mutans oraz otrzymanych mutantów na wybrane antybiotyki i chemioterapeutyki. Pobrane zostaną wymazy z powierzchni zębów dzieci oraz dorosłych i posiane na podłoże Mitis Salivarius Agar uzupełnione sacharozą, bacytracyną i tellurynem potasu, po czym inkubowane przez 48 h w temperaturze 37°C w 5% stężeniu C02. Identyfikacja obejmować będzie dwa etapy: identyfikację na podstawie cech biochemicznych oraz identyfikację genetyczną z zastosowaniem metody nested-PCR. W dalszej części projekt będzie bazował na podstawowych technikach biologii molekularnej (tj. izolacja materiału genetycznego, PCR, Multiplex PCR. analiza restrykcyjna itp.). Do identyfikacji 13 TCS posłuży metoda Multiplex PCR i/lub klasyczny PCR. Do inaktywacji genów kodujących systemy dwuskładnikowe z kolei wykorzystana zostanie metoda mutagenezy ligacyjnej. Zdolność i intensywność tworzenia biofilmu in vitro na polistyrenowych płytkach titracyjnych zarówno przez izolaty kliniczne jak i szczepy zmutowane oceniana będzie metodą barwienia fioletem krystalicznym oraz metodą barwienia MTT z wykorzystaniem spektrofotometru. Hodowla biofilmu zakładana będzie na podłożu BHI i inkubowana w temperaturze 37°C w 5% stężeniu CO., przez 24h do 48h. Z kolei struktura biofilmu badana będzie za pomocą elektronowej mikroskopii skaningowej. Ocena lekowrażliwości szczepów klinicznych S. mutans i mutantów przeprowadzona zostanie z wykorzystaniem systemu Vitek-2 Compact. S. mutans jest jednym z najważniejszych gatunków drobnoustrojów spośród mikroflory zasiedlającej jamę ustną osób dorosłych i dzieci bezpośrednio związany z powstawaniem próchnicy zębów stałych oraz mlecznych. Próchnica stanowi bardzo poważne i powszechnie występujące schorzenie o podłożu zakaźnym i mimo postępów w dziedzinach stomatologii oraz higieny, pozostaje wciąż istotnym problemem naszego społeczeństwa. Jednym z ważnych czynników wirulencji bakterii prochnicotwórczych w tym S. mutans jest zdolność do tworzenia płytki nazębnej tzw. naturalnego biofilmu. W zróżnicowanym środowisku jakim jest jama ustna bakterie żyjące w strukturze biofilmu narażone są na różnego rodzaju niekorzystne czynniki środowiskowe tj.: zmiany temperatury, warunków żywieniowych oraz natężenie tlenu. Ich zdolność do adaptacji, przetrwania oraz wywołania tak poważnej jednostki chorobowej jaką jest próchnica wskazuje na konieczność dogłębnej analizy molekularnych mechanizmów odpowiedzi bakterii żyjących w biofilmie na napotkane warunki stresowe. Jak wykazano w przypadku S. mutans odpowiedź na zmiany zachodzące w środowisku odbywa się z udziałem dwuskładnikowych systemów regulacyjnych. Dlatego dogłębne poznanie budowy i funkcjonowania TCS wydaję się niezbędne do całkowitej eliminacji bądź modyfikacji cech tego drobnoustroju tym bardziej, że badania ostatnich lat wykazały, że dwuskładnikowe systemy regulacyjne mogą stanowić nowe potencjalne miejsca działania leków.